Sinisimpukan geeniaktiivisuuden määritys qPCR-menetelmällä
Sandberg, Janita (2019)
Sandberg, Janita
2019
Kaikki oikeudet pidätetään
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201903132863
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201903132863
Tiivistelmä
Itämerellä kuljetettavan raakaöljyn ja öljyjalosteiden määrän on ennustettu kasvavan huomattavasti lähivuosina. On tärkeää tutkia öljyn vaikutuksia eliöihin, sillä Itämerellä mahdollisen öljyonnettomuuden riski on suuri. Itämeren ominaisuudet, kuten veden mataluus ja hidas vaihtuminen, murtovesi sekä kylmyys tekevät siitä herkän likaantumiselle ja sen aiheuttamille vaikutuksille.
Tämä opinnäytetyö on tehty Suomen ympäristökeskuksessa. Työn tavoitteena oli ottaa käyttöön qPCR-menetelmä, jonka avulla tutkitaan geeniaktiivisuutta kudoksessa. Menetelmän tarkoituksena on selvittää, kuinka haitalliset aineet vaikuttavat tutkittavaan sinisimpukkaan (Mytilus Trossulus) oksidatiivisen stressin näkökulmasta. Simpukoita altistettiin öljylle, jonka komponentit synnyttävät eliöissä happiradikaaleja. Kun eliön happiradikaalien määrä kasvaa, myös antioksidanttien määrän on noustava. Eliön geenit tuottavat antioksidantteja neutraloimaan happiradikaaleja. Mikäli happiradikaaleja on antioksidantteihin nähden liikaa, puhutaan oksidatiivisesta stressistä. Tällöin happiradikaalit aiheuttavat solussa proteiinien, lipidien ja DNA:n vahingoittumisen ja pahimmassa tapauksessa solukuoleman.
Näytteinä käytetyt simpukat oli haettu Itämerestä mahdollisimman puhtaalta alueelta. Simpukoille tehtiin yksi koeasetelma, jossa oli käytössä kolme erilaista käsittelyä: kontrollit, matala pitoisuus öljyä vedessä ja korkea pitoisuus öljyä vedessä. Osaa simpukoista altistettiin yhden päivän ajan ja toista koeryhmää seitsemän päivän ajan. Kolmas koeryhmä siirrettiin vielä seitsemän päivän altistuksen jälkeen puhtaaseen veteen viikoksi. qPCR-menetelmällä mitattiin oksidatiivisen stressin torjumiseen ja mahdollisiin muihin vaikutuksiin liittyvien geenien aktiivisuuksia.
RNA-näytteiden laatu varmistettiin bioanalysaattorilla. Kuoppalevyjen välisiä eroja ja replikaattien varianssia tarkasteltiin laskemalla variaatiokertoimia, joiden tuli jäädä alle viiden prosentin. Kaikissa tavoite saavutettiin. Kontrollien tuloksia verrattiin ANOVAlla matalapitoisiin ja korkeapitoisiin käsittelyihin. Kontrollien ja matalien pitoisuuksien välillä p-arvot olivat yli 0,05. Näin ollen eroja niiden välillä ei ollut. Korkeiden pitoisuuksien ja kontrollien välillä joidenkin geenien p-arvo oli yli 0,05 päivänä 1 ja toisien geenien kohdalla päivänä 7.
Tämä opinnäytetyö on tehty Suomen ympäristökeskuksessa. Työn tavoitteena oli ottaa käyttöön qPCR-menetelmä, jonka avulla tutkitaan geeniaktiivisuutta kudoksessa. Menetelmän tarkoituksena on selvittää, kuinka haitalliset aineet vaikuttavat tutkittavaan sinisimpukkaan (Mytilus Trossulus) oksidatiivisen stressin näkökulmasta. Simpukoita altistettiin öljylle, jonka komponentit synnyttävät eliöissä happiradikaaleja. Kun eliön happiradikaalien määrä kasvaa, myös antioksidanttien määrän on noustava. Eliön geenit tuottavat antioksidantteja neutraloimaan happiradikaaleja. Mikäli happiradikaaleja on antioksidantteihin nähden liikaa, puhutaan oksidatiivisesta stressistä. Tällöin happiradikaalit aiheuttavat solussa proteiinien, lipidien ja DNA:n vahingoittumisen ja pahimmassa tapauksessa solukuoleman.
Näytteinä käytetyt simpukat oli haettu Itämerestä mahdollisimman puhtaalta alueelta. Simpukoille tehtiin yksi koeasetelma, jossa oli käytössä kolme erilaista käsittelyä: kontrollit, matala pitoisuus öljyä vedessä ja korkea pitoisuus öljyä vedessä. Osaa simpukoista altistettiin yhden päivän ajan ja toista koeryhmää seitsemän päivän ajan. Kolmas koeryhmä siirrettiin vielä seitsemän päivän altistuksen jälkeen puhtaaseen veteen viikoksi. qPCR-menetelmällä mitattiin oksidatiivisen stressin torjumiseen ja mahdollisiin muihin vaikutuksiin liittyvien geenien aktiivisuuksia.
RNA-näytteiden laatu varmistettiin bioanalysaattorilla. Kuoppalevyjen välisiä eroja ja replikaattien varianssia tarkasteltiin laskemalla variaatiokertoimia, joiden tuli jäädä alle viiden prosentin. Kaikissa tavoite saavutettiin. Kontrollien tuloksia verrattiin ANOVAlla matalapitoisiin ja korkeapitoisiin käsittelyihin. Kontrollien ja matalien pitoisuuksien välillä p-arvot olivat yli 0,05. Näin ollen eroja niiden välillä ei ollut. Korkeiden pitoisuuksien ja kontrollien välillä joidenkin geenien p-arvo oli yli 0,05 päivänä 1 ja toisien geenien kohdalla päivänä 7.