Virtaussytometrian testaus GLUT4-translokaation tutkimisessa ja metodissa käytettävien vasta-aineiden validointi
Helenius, Johanna; Mikkonen, Pauliina (2017)
Helenius, Johanna
Mikkonen, Pauliina
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2017
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2017113019079
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2017113019079
Tiivistelmä
Opinnäytetyön tarkoituksena oli testata virtaussytometrian toimivuutta GLUT4-proteiinin translokaation tutkimisessa sekä validoida menetelmässä käytettyjä vasta-aineita. Työ toteutettiin yhteistyössä Lääketieteellisen tutkimuslaitos Minervan kanssa. Tavoitteena oli selvittää, voitaisiinko virtaussytometriaa menetelmänä käyttää tyypin 2 diabetekselle altistavan suomalaisspesifisen AKT2-geenivariantin tutkimisessa. AKT2-geenivariantti liittyy heikentyneeseen insuliinin signaalinsiirtoon, mikä mahdollisesti vaikuttaa GLUT4-glukoositransportterin toimintaan.
GLUT4-glukoositransportteri on normaalitilassa solunsisäisinä rakkuloina, mutta siirtyy insuliinin vaikutuksesta nopeasti solukalvolle. Tämä insuliinin stimuloima glukoosin kuljetus lihassoluihin on keskeinen tekijä veren glukoosipitoisuuden säätelyssä. Tyypin 2 diabeteksessa insuliinin signaalireitissä esiintyy kuitenkin poikkeamia, jotka heikentävät GLUT4-transportterin siirtymistä solukalvolle ja glukoosin kuljetusta soluun.
Koehenkilöiltä oli aikaisemman tutkimuksen yhteydessä kerätty biopsianäytteitä reiden vastus lateralis-lihaksesta. Näistä näytteistä oli luotu primaariset soluviljelmät, joita tässä opinnäytetyössä käytettiin virtaussytometrian testaamiseen, sekä vasta-aineiden validointiin western blotilla ja immunofluoresenssivärjäyksillä.
Virtaussytometriaa lähdettiin testaamaan aiemman julkaisun pohjalta, mutta sitä ei saatu toimimaan odotetulla tavalla. Parhaat tulokset menetelmässä saatiin käyttämällä Santa Cruzin vasta-ainetta. Kaksi muuta testauksen kohteena ollutta vasta-ainetta eivät antaneet menetelmässä järkeviä tuloksia. Myös vasta-aineiden validoinnissa Santa Cruzin vasta-aine osoittautui toimivimmaksi. Virtaussytometrian toimivuus GLUT4-translokaation tutkimisessa jäi vielä epäselväksi ja tulevaisuudessa menetelmän optimointia tulisi jatkaa selvittämällä optimaalinen vasta-ainepitoisuus titraamalla, sekä käyttämällä täysin negatiivisia, GLUT4:ä sisältämättömiä kontrollisoluja.
GLUT4-glukoositransportteri on normaalitilassa solunsisäisinä rakkuloina, mutta siirtyy insuliinin vaikutuksesta nopeasti solukalvolle. Tämä insuliinin stimuloima glukoosin kuljetus lihassoluihin on keskeinen tekijä veren glukoosipitoisuuden säätelyssä. Tyypin 2 diabeteksessa insuliinin signaalireitissä esiintyy kuitenkin poikkeamia, jotka heikentävät GLUT4-transportterin siirtymistä solukalvolle ja glukoosin kuljetusta soluun.
Koehenkilöiltä oli aikaisemman tutkimuksen yhteydessä kerätty biopsianäytteitä reiden vastus lateralis-lihaksesta. Näistä näytteistä oli luotu primaariset soluviljelmät, joita tässä opinnäytetyössä käytettiin virtaussytometrian testaamiseen, sekä vasta-aineiden validointiin western blotilla ja immunofluoresenssivärjäyksillä.
Virtaussytometriaa lähdettiin testaamaan aiemman julkaisun pohjalta, mutta sitä ei saatu toimimaan odotetulla tavalla. Parhaat tulokset menetelmässä saatiin käyttämällä Santa Cruzin vasta-ainetta. Kaksi muuta testauksen kohteena ollutta vasta-ainetta eivät antaneet menetelmässä järkeviä tuloksia. Myös vasta-aineiden validoinnissa Santa Cruzin vasta-aine osoittautui toimivimmaksi. Virtaussytometrian toimivuus GLUT4-translokaation tutkimisessa jäi vielä epäselväksi ja tulevaisuudessa menetelmän optimointia tulisi jatkaa selvittämällä optimaalinen vasta-ainepitoisuus titraamalla, sekä käyttämällä täysin negatiivisia, GLUT4:ä sisältämättömiä kontrollisoluja.