ɣ–sekretaasin inhibiittorien vaikutus rintasyöpäsolujen proliferaatioon ja viabiliteettiin
Kastinen, Miia; Lemettinen, Marjo (2014)
Kastinen, Miia
Lemettinen, Marjo
Savonia-ammattikorkeakoulu
2014
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201404285163
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201404285163
Tiivistelmä
ɣ-sekretaasi on soluissa esiintyvä proteiineja solukalvolla pilkkova entsyymi. Monilla ɣ-sekretaasin substraateilla on yhteys muun muassa syövän syntyyn ja kehittymiseen vaikuttaviin mekanismeihin. Yksi ɣ-sekretaasin kohdeproteiineista on Notch. Notch-signalointi on yksi solujen viestinvälitysreiteistä, mikä vaikuttaa normaalisti terveissä soluissa muun muassa solujen kehitykseen ja erilaistumiseen. Onkogeeninä toimiessaan Notch-signalointi aiheuttaa esimerkiksi rintasyöpää. ɣ-sekretaasin toimintaa voidaan estää erilaisten kemiallisten yhdisteiden, inhibiittorien avulla. Kun ɣ-sekretaasin toiminta estetään, estyy myös Notch-signaloinnin se vaihe, minkä kautta Notch-proteiini pystyy aktivoitumaan ja toimimaan onkogeeninä. Kirjallisuudessa on esitetty, että ɣ-sekretaasin inhibiittoreita voitaisiin käyttää lääkkeenä syövän hoitoon.
Tämän opinnäytyön tarkoituksena oli kokeellisesti todeta, vaikuttaako ɣ-sekretaasin toiminnan inhiboiminen käytössämme olevilla inhibiittoreilla (DAPT, L-685,458 ja Compound E) rintasyöpäsolujen proliferaatioon ja viabiliteettiin. Työ toteutettiin soluviljelemällä kolmea eri solulinjaa, joista yksi toimi kontrollisolulinjana ja kaksi olivat rintasyöpäsolulinjoja. Solulinjoihin lisättiin inhibiittorit, joista käytettiin eri konsentraatioita. Inhibiittorien vaikutukset mitattiin 24, 48 ja 72 tunnin jälkeen inhibiittorien lisäämisestä. Vaikutusten mittaamiseen käytettiin kahta eri menetelmää, joista toinen perustui solujen laskemiseen Scepter™-solulaskijalla ja toinen menetelmä kolorimetriseen määritykseen WST-1-reagenssilla. Kokeellisen osuuden laboratoriotutkimusprosessi, menetelmien ongelmat ja tulokset raportoitiin tähän opinnäytetyöhön.
Tämä opinnäytetyö oli pieni kokeellinen osa yliopiston laajaa rintasyöpätutkimusta. Tämän työn tavoitteena oli olla aiheen tarjonneelle yksikölle hyödyksi ja tarjota jatkotutkimusmahdollisuuksia tämän työn tuloksista. Tavoitteena oli myös lisätä tietoa ɣ-sekretaasin inhibiittorien vaikutuksista rintasyöpäsoluihin.
ɣ-sekretaasin inhibiittorien vaikutuksista käytettyihin solulinjoihin muodostettiin pylväsdiagrammit vertaamalla inhibiittorien vaikutusta inhibiittorikäsitellyissä- ja kontrollisoluissa. Scepter™-kokeen tuloksissa oli paljon hajontaa. Tämän kokeen perusteella ei voi tehdä selviä johtopäätöksiä tuloksista, koska Scepter™-menetelmän työläydestä johtuen, mittauksia ei tehty tieteellisen tutkimuksen kriteereiden vaatimaa kolmea rinnakkaista mittausta. Lupaavin rintasyöpäsolujen proliferaatiota ja viabiliteettiä hillitsevä vaikutus näytti olevan DAPT-inhibiittorin 20 µM konsentraatiolla MCF-7-solulinjalla. WST-1-kokeen tulosten analysointiin käytettiin IBM® SPSS® Statistics -ohjelmaa. WST-1-kokeessa Compound E-inhibiittorilla oli merkitsevä vaikutus MCF-12F-solujen proliferaatioon ja viabiliteettiin 48 tunnin vaikutusajalla. DAPT-inhibiittorilla oli merkitsevä vaikutus MDA-MB-453-soluihin 72 tunnin vaikutusajalla.
Tämän opinnäytyön tarkoituksena oli kokeellisesti todeta, vaikuttaako ɣ-sekretaasin toiminnan inhiboiminen käytössämme olevilla inhibiittoreilla (DAPT, L-685,458 ja Compound E) rintasyöpäsolujen proliferaatioon ja viabiliteettiin. Työ toteutettiin soluviljelemällä kolmea eri solulinjaa, joista yksi toimi kontrollisolulinjana ja kaksi olivat rintasyöpäsolulinjoja. Solulinjoihin lisättiin inhibiittorit, joista käytettiin eri konsentraatioita. Inhibiittorien vaikutukset mitattiin 24, 48 ja 72 tunnin jälkeen inhibiittorien lisäämisestä. Vaikutusten mittaamiseen käytettiin kahta eri menetelmää, joista toinen perustui solujen laskemiseen Scepter™-solulaskijalla ja toinen menetelmä kolorimetriseen määritykseen WST-1-reagenssilla. Kokeellisen osuuden laboratoriotutkimusprosessi, menetelmien ongelmat ja tulokset raportoitiin tähän opinnäytetyöhön.
Tämä opinnäytetyö oli pieni kokeellinen osa yliopiston laajaa rintasyöpätutkimusta. Tämän työn tavoitteena oli olla aiheen tarjonneelle yksikölle hyödyksi ja tarjota jatkotutkimusmahdollisuuksia tämän työn tuloksista. Tavoitteena oli myös lisätä tietoa ɣ-sekretaasin inhibiittorien vaikutuksista rintasyöpäsoluihin.
ɣ-sekretaasin inhibiittorien vaikutuksista käytettyihin solulinjoihin muodostettiin pylväsdiagrammit vertaamalla inhibiittorien vaikutusta inhibiittorikäsitellyissä- ja kontrollisoluissa. Scepter™-kokeen tuloksissa oli paljon hajontaa. Tämän kokeen perusteella ei voi tehdä selviä johtopäätöksiä tuloksista, koska Scepter™-menetelmän työläydestä johtuen, mittauksia ei tehty tieteellisen tutkimuksen kriteereiden vaatimaa kolmea rinnakkaista mittausta. Lupaavin rintasyöpäsolujen proliferaatiota ja viabiliteettiä hillitsevä vaikutus näytti olevan DAPT-inhibiittorin 20 µM konsentraatiolla MCF-7-solulinjalla. WST-1-kokeen tulosten analysointiin käytettiin IBM® SPSS® Statistics -ohjelmaa. WST-1-kokeessa Compound E-inhibiittorilla oli merkitsevä vaikutus MCF-12F-solujen proliferaatioon ja viabiliteettiin 48 tunnin vaikutusajalla. DAPT-inhibiittorilla oli merkitsevä vaikutus MDA-MB-453-soluihin 72 tunnin vaikutusajalla.