Soluviabiliteetin mittausmenetelmän käyttöönotto
Jänisniemi, Olga (2019)
Jänisniemi, Olga
2019
All rights reserved. This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2019121627065
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2019121627065
Tiivistelmä
Tämä opinnäytetyö tehtiin Terveyden ja hyvinvoinnin laitoksen (THL) Virusinfektioyksikössä. Vakavia virusinfektioita tutkivassa tutkimusryhmässä oli jo pitkään ollut tarve aiempaa nopeammalle ja yksinkertaisemmalle, edulliselle antiviraaliaineiden toimivuuden testausmenetelmälle, jota hyödyntämällä voitaisiin lyhentää työskentelyaikaa vahvojen henkilönsuojaimien käyttöä vaativassa BSL-3-laboratoriossa. Lisäksi haluttiin tulosten olevan riippumattomia työntekijän subjektiivisesta tulkinnasta, toisin kuin mikroskopointiin perustuvissa menetelmissä.
Käyttöön otettavaksi valittiin Thermo Fisherin tuotevalikoimaan kuuluva PrestoBlue-reagenssi, joka mittaa soluviabiliteettia resatsuriinin pelkistysreaktion avulla. Elävät, metabolisesti aktiiviset solut pelkistävät sinisen resatsuriinin aniliininpunaiseksi resorufiiniksi – värinmuutos on sitä voimakkaampi, mitä enemmän eläviä soluja näyte sisältää. Reagenssin käyttö ja tulosten tulkinta on yksinkertaista: käyttövalmista liuosta annostellaan soluille ja inkuboinnin jälkeen kuoppalevylle tehdään absorbanssimittaus kahdella aallonpituudella. Mittaustulosten pohjalta lasketaan korjattu absorbanssi, joka on sitä korkeampi, mitä parempi solujen viabiliteetti on.
Reagenssia testattiin eri influenssaviruksilla infektoiduilla solulinjoilla ja makrofageilla. Osalla solulinjoista reagenssia ei saatu lainkaan toimimaan valmistajan kuvaamalla tavalla, vaan voimakkain värinmuutosreaktio ja korkeimmat absorbanssiarvot mitattiin toistuvasti voimakkaimmin infektoituneista kuoppalevyn kuopista. Yhdellä solulinjalla saatiin alustavasti oikeansuuntaisia tuloksia, mutta jatkotestaukseen ei tämän opinnäytetyön puitteissa jäänyt aikaa. Odottamattomien tulosten syytä yritettiin selvittää sulkemalla pois mahdollisia virhelähteitä, kuten solujen kasvatuksessa käytetyn ravintoliuoksen ainesosien vaikutusta resatsuriinin pelkistysreaktioon. Makrofageilla reagenssi toimi valmistajan ilmoittamalla tavalla, mutta niiden haittapuolena on ylläpidon työläys ja kalleus.
Syytä reagenssin odotetusta poikkeavalle toiminnalle ei tämän opinnäytetyön puitteissa pystytty osoittamaan, mutta sen arveltiin mahdollisesti liittyvän jonkinlaiseen solun ja viruksen yhteisvaikutukseen. Lopputulemana joka tapauksessa oli, ettei uutta soluviabiliteetin mittausmenetelmää saatu käyttöön.
Käyttöön otettavaksi valittiin Thermo Fisherin tuotevalikoimaan kuuluva PrestoBlue-reagenssi, joka mittaa soluviabiliteettia resatsuriinin pelkistysreaktion avulla. Elävät, metabolisesti aktiiviset solut pelkistävät sinisen resatsuriinin aniliininpunaiseksi resorufiiniksi – värinmuutos on sitä voimakkaampi, mitä enemmän eläviä soluja näyte sisältää. Reagenssin käyttö ja tulosten tulkinta on yksinkertaista: käyttövalmista liuosta annostellaan soluille ja inkuboinnin jälkeen kuoppalevylle tehdään absorbanssimittaus kahdella aallonpituudella. Mittaustulosten pohjalta lasketaan korjattu absorbanssi, joka on sitä korkeampi, mitä parempi solujen viabiliteetti on.
Reagenssia testattiin eri influenssaviruksilla infektoiduilla solulinjoilla ja makrofageilla. Osalla solulinjoista reagenssia ei saatu lainkaan toimimaan valmistajan kuvaamalla tavalla, vaan voimakkain värinmuutosreaktio ja korkeimmat absorbanssiarvot mitattiin toistuvasti voimakkaimmin infektoituneista kuoppalevyn kuopista. Yhdellä solulinjalla saatiin alustavasti oikeansuuntaisia tuloksia, mutta jatkotestaukseen ei tämän opinnäytetyön puitteissa jäänyt aikaa. Odottamattomien tulosten syytä yritettiin selvittää sulkemalla pois mahdollisia virhelähteitä, kuten solujen kasvatuksessa käytetyn ravintoliuoksen ainesosien vaikutusta resatsuriinin pelkistysreaktioon. Makrofageilla reagenssi toimi valmistajan ilmoittamalla tavalla, mutta niiden haittapuolena on ylläpidon työläys ja kalleus.
Syytä reagenssin odotetusta poikkeavalle toiminnalle ei tämän opinnäytetyön puitteissa pystytty osoittamaan, mutta sen arveltiin mahdollisesti liittyvän jonkinlaiseen solun ja viruksen yhteisvaikutukseen. Lopputulemana joka tapauksessa oli, ettei uutta soluviabiliteetin mittausmenetelmää saatu käyttöön.