CRISPR/Cas9-menetelmän optimointi T. reesei -transformaatiossa
Mero, Siiri (2017)
Mero, Siiri
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2017
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2017120119313
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2017120119313
Tiivistelmä
Opinnäytetyö suoritettiin Teknologian tutkimuskeskus VTT:n tiloissa laboratoriossa, jossa kehitetään rihmasienikantoja proteiinien tuottoa varten. Työn tarkoituksena oli optimoida käytettävää Trichoderma reesei -transformaatiota, jossa geneettistä materiaalia siirretään PEG 6000 välitteisesti protoplastien avulla solusta toiseen. Optimoinnin tavoitteena oli tulevaisuudessa saada säästettyä sekä aikaa että resursseja.
CRISPR/Cas9 on vuonna 2012 kehitetty genominmuokkausmenetelmä, jonka toiminta perustuu Cas9 endonukleaasientsyymin toimintaan. Menetelmässä tarvitaan myös gRNA-kompleksi, joka on muodostunut crRNA:sta ja tracrRNA:sta. gRNA:n sekvenssin avulla Cas9 ohjautuu tiettyyn kohtaan genomisessa DNA:ssa. Mikä tekee CRISPR/Cas9 -menetelmästä niin merkittävän, on sen tarkkuus ja nopeus; DNA-juoste saadaan katkaistua tehokkaasti juuri oikeasta kohdasta vähäisellä työllä.
Neljän eri transformaation kautta vertailtiin ja selvitettiin esimerkiksi eri transformaatioliuosten optimaalisia pitoisuuksia, donor-DNA:n määrän vaikutusta saatujen pesäkkeiden määriin sekä crRNA:iden mahdollisuutta targetoitua kahteen eri lokukseen samassa transformaatiossa. Alussa selvitettiin myös parasta selektiomarkkeria tulevia transformaatioita varten.
Tuloksista selvisi transformaatioiden onnistuvan vähennetyllä protoplastien määrällä, sillä transformaatiot toistettiin niin monta kertaa, että pesäkkeiden suuri määrä ei voinut olla esimerkiksi kontaminaatiosta johtuva. Kokeilla todistettiin myös, että käytetyllä donor-DNA:n määrällä on vaikutusta saatujen pesäkkeiden lukumäärään sekä optimaalisten pitoisuuksien vaihtelevan käytetystä crRNA:sta riippuen.
Viimeisenä tehtiin PCR-seulonnat, joilla selvitettiin mihin klooneihin oli onnistuneesti saatu CRIPSR-menetelmän avulla siirrettyä haluttu DNA-jakso. Myös kahteen eri lokukseen targetoituneita crRNA:ita oli useita tapauksia. Tulosten perusteella menetelmän toimivuus todettiin onnistuneeksi.
CRISPR/Cas9 on vuonna 2012 kehitetty genominmuokkausmenetelmä, jonka toiminta perustuu Cas9 endonukleaasientsyymin toimintaan. Menetelmässä tarvitaan myös gRNA-kompleksi, joka on muodostunut crRNA:sta ja tracrRNA:sta. gRNA:n sekvenssin avulla Cas9 ohjautuu tiettyyn kohtaan genomisessa DNA:ssa. Mikä tekee CRISPR/Cas9 -menetelmästä niin merkittävän, on sen tarkkuus ja nopeus; DNA-juoste saadaan katkaistua tehokkaasti juuri oikeasta kohdasta vähäisellä työllä.
Neljän eri transformaation kautta vertailtiin ja selvitettiin esimerkiksi eri transformaatioliuosten optimaalisia pitoisuuksia, donor-DNA:n määrän vaikutusta saatujen pesäkkeiden määriin sekä crRNA:iden mahdollisuutta targetoitua kahteen eri lokukseen samassa transformaatiossa. Alussa selvitettiin myös parasta selektiomarkkeria tulevia transformaatioita varten.
Tuloksista selvisi transformaatioiden onnistuvan vähennetyllä protoplastien määrällä, sillä transformaatiot toistettiin niin monta kertaa, että pesäkkeiden suuri määrä ei voinut olla esimerkiksi kontaminaatiosta johtuva. Kokeilla todistettiin myös, että käytetyllä donor-DNA:n määrällä on vaikutusta saatujen pesäkkeiden lukumäärään sekä optimaalisten pitoisuuksien vaihtelevan käytetystä crRNA:sta riippuen.
Viimeisenä tehtiin PCR-seulonnat, joilla selvitettiin mihin klooneihin oli onnistuneesti saatu CRIPSR-menetelmän avulla siirrettyä haluttu DNA-jakso. Myös kahteen eri lokukseen targetoituneita crRNA:ita oli useita tapauksia. Tulosten perusteella menetelmän toimivuus todettiin onnistuneeksi.