Electrical Communication and its Physiological Relevance in Retinal Pigment Epithelium
Fadjukov, Julia (2023)
Fadjukov, Julia
Tampere University
2023
Lääketieteen, biotieteiden ja biolääketieteen tekniikan tohtoriohjelma - Doctoral Programme in Medicine, Biosciences and Biomedical Engineering
Lääketieteen ja terveysteknologian tiedekunta - Faculty of Medicine and Health Technology
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Väitöspäivä
2023-03-31
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:ISBN:978-952-03-2824-5
https://urn.fi/URN:ISBN:978-952-03-2824-5
Tiivistelmä
Verkkokalvon pigmenttiepiteeli (eng. retinal pigment epithelium, RPE) tekee tiivistä yhteistyötä verkkokalvon kanssa turvatakseen näköaistin toiminnan. Useita RPE:n tärkeimpiä tehtäviä, kuten valoa aistivien näköaistinsolujen uusiutumista, säädellään ionikanavien avulla. Näiden kanavien toimintaa ja RPE:n kykyä säädellä kalvopotentiaaliaan ei kuitenkaan vielä täysin ymmärretä. Tässä väitöskirjatyössä tutkittiin jänniteherkkien ionikanavien toimintaa sekä RPE:n sähköistä kytkeytyvyyttä käyttäen mallina ihmisen alkion kantasoluista erilaistettuja RPE-soluja sekä hiiren RPE-kudosta.
Jänniteherkät natriumkanavat (NaV) tunnetaan parhaiten osallisuudestaan aktiopotentiaalin synnyssä hermosoluissa, mutta näiden kanavien tiedetään esiintyvän myös useissa muissa solutyypeissä, kuten makrofageissa ja astrosyyteissä, joissa aktiopotentiaaleja ei lähtökohtaisesti muodostu. NaV kanavien ei kuitenkaan uskottu esiintyvän RPE-kudoksessa huolimatta siitä, että niitä on toisinaan havaittu RPE-soluviljelmissä. Tämä väitöskirjatyö osoitti, että sekä kantasoluista erilaistetuissa RPE-soluissa että hiiren RPE-soluissa ilmentyy useita NaV- kanavaperheen alatyyppejä. Samalla havaittiin, että aikaisempi virheellinen johtopäätös aiheutui tutkimusten suorittamisesta yksittäisillä soluilla toiminnallisen kudoksen sijaan. Tässä työssä osoitettiin myös löydettyjen Nav-kanavatyyppien toiminnallisuus sähköfysiologisilla mittauksilla. Merkittävimpien kanavatyyppien (NaV1.4–NaV1.6 sekä NaV1.8) havaittiin sijoittuvan solu-soluliitoksiin tai RPE:n apikaaliselle solukalvolle.
RPE-solujen sähköfysiogisia mittauksia on tyypillisesti tehty yksittäisistä eristetyistä soluista. Tästä johtuen RPE-solujen sähköistä kytkeytyvyyttä ei ole selvitetty nisäkkäillä, vaikka tiedetään, että aukkoliitoksilla on tärkeitä tehtäviä silmän kehityksessä. Tämä väitöskirjatyö osoitti, että solujen merkittävin aukkoliitosproteiini (engl. Connexin, Cx) on Cx43, jonka havaittiin muodostavan sekä aukkoliitoksia että puolikkaita hemikanavia solujen apikaalisella pinnalla. Sähköfysiologiset mittaukset osoittivat, että RPE:n laajasta aukkoliitosten verkostosta huolimatta RPE-solujen välinen kytkeytyvyys on suhteellisen alhainen. Kytkeytyvyyttä voitiin kuitenkin säädellä aukkoliitosten farmakologisilla estäjillä, tai estämällä tietyn Cdk5 (engl. cyclin-dependent kinase 5) kinaasi-entsyymin toimintaa.
NaV-kanavien ja aukkoliitosten merkitystä RPE:n fysiologiassa tutkittiin keskittymällä näköaistinsolujen kalvojen uusiutumiseen, jossa RPE:n solusyönti eli fagosytoosi on merkittävässä roolissa. Tulokset osoittivat, että fagosytoosin aikana NaV-alatyypit NaV1.4 ja NaV1.8 esiintyvät lähellä näköaistinsolujen kalvopartikkeleita. NaV-kanavien toiminnan estäminen farmakologisesti tai geneettisesti (engl. short hairpin RNA, shRNA) vähensi merkittävästi fagosytoosin tehokkuutta. Lisäksi näiden kanavien havaittiin paikantuvan sekä apikaalipinnalle muodostuviin fagosytoosi-kuppeihin, että jo sisään otettuihin fagosomeihin yhdessä endosomien markkeriproteiinien (engl. rat sarcoma virus-related protein, Rab7) kanssa. Nämä tulokset antavat viitteitä siitä, että NaV-kanavilla olisi monipuolisia tehtäviä fagosytoosin aikana.
NaV-kanavien lisäksi myös Cx43:n havaittiin esiintyvän näköaistinsolujen kalvopartikkelien kanssa fagosytoosissa ja tulokset antavat viitteitä siitä, että aukkoliitoksia otetaan solujen sisälle prosessin aikana. Fosforylaation havaittiin säätelevän tätä aukkoliitosten siirtymää ja erityisesti Cdk5-, ja proteiinikinaasi C- entsyymeillä oli merkittävä rooli tässä säätelyssä. Tämän työn tulokset osoittivat, että Cx43 liittyy fagosytoosikuppien muodostukseen sekä solujen aktiini-tukirangan uudelleen järjestymiseen. Fagosytoosin säätelyn tiedetään perustuvan vuorokausirytmiin ja mielenkiintoista on, että Cdk5-kinaasin on osoitettu vaikuttavan tähän rytmiin. On siis mahdollista, että Cdk5 auttaa myös fagosytoosin ajoituksen säätelyssä.
Kokonaisuutena työni osoittaa RPE:n fysiologian ja sen ionikanavakoneiston säätelyn monimutkaisuuden. Nav-kanavien roolin on havaittu olevan huomattavasti monipuolisempi kuin aktiopotentiaalien muodostus hermosoluissa ja tuloksemme vahvistavat tätä käsitystä. Yksi työni yllättävimmistä ja merkittävimmistä tuloksista oli, että RPE voi säädellä kalvojännitettään ja epiteelikudoksen solujen välistä viestintäänsä nopeasti. Tarkemmat tiedot tämän ionisignaloinnin roolista fagosytoosissa lisäävät ymmärrystämme prosessista, joka on merkittävä näkökyvyllemme. Yhteenvetona tämä työ osoittaa, että RPE:n rooli yhteistyössä verkkokalvon kanssa on paljon aktiivisempi kuin on aikaisemmin luultu.
Jänniteherkät natriumkanavat (NaV) tunnetaan parhaiten osallisuudestaan aktiopotentiaalin synnyssä hermosoluissa, mutta näiden kanavien tiedetään esiintyvän myös useissa muissa solutyypeissä, kuten makrofageissa ja astrosyyteissä, joissa aktiopotentiaaleja ei lähtökohtaisesti muodostu. NaV kanavien ei kuitenkaan uskottu esiintyvän RPE-kudoksessa huolimatta siitä, että niitä on toisinaan havaittu RPE-soluviljelmissä. Tämä väitöskirjatyö osoitti, että sekä kantasoluista erilaistetuissa RPE-soluissa että hiiren RPE-soluissa ilmentyy useita NaV- kanavaperheen alatyyppejä. Samalla havaittiin, että aikaisempi virheellinen johtopäätös aiheutui tutkimusten suorittamisesta yksittäisillä soluilla toiminnallisen kudoksen sijaan. Tässä työssä osoitettiin myös löydettyjen Nav-kanavatyyppien toiminnallisuus sähköfysiologisilla mittauksilla. Merkittävimpien kanavatyyppien (NaV1.4–NaV1.6 sekä NaV1.8) havaittiin sijoittuvan solu-soluliitoksiin tai RPE:n apikaaliselle solukalvolle.
RPE-solujen sähköfysiogisia mittauksia on tyypillisesti tehty yksittäisistä eristetyistä soluista. Tästä johtuen RPE-solujen sähköistä kytkeytyvyyttä ei ole selvitetty nisäkkäillä, vaikka tiedetään, että aukkoliitoksilla on tärkeitä tehtäviä silmän kehityksessä. Tämä väitöskirjatyö osoitti, että solujen merkittävin aukkoliitosproteiini (engl. Connexin, Cx) on Cx43, jonka havaittiin muodostavan sekä aukkoliitoksia että puolikkaita hemikanavia solujen apikaalisella pinnalla. Sähköfysiologiset mittaukset osoittivat, että RPE:n laajasta aukkoliitosten verkostosta huolimatta RPE-solujen välinen kytkeytyvyys on suhteellisen alhainen. Kytkeytyvyyttä voitiin kuitenkin säädellä aukkoliitosten farmakologisilla estäjillä, tai estämällä tietyn Cdk5 (engl. cyclin-dependent kinase 5) kinaasi-entsyymin toimintaa.
NaV-kanavien ja aukkoliitosten merkitystä RPE:n fysiologiassa tutkittiin keskittymällä näköaistinsolujen kalvojen uusiutumiseen, jossa RPE:n solusyönti eli fagosytoosi on merkittävässä roolissa. Tulokset osoittivat, että fagosytoosin aikana NaV-alatyypit NaV1.4 ja NaV1.8 esiintyvät lähellä näköaistinsolujen kalvopartikkeleita. NaV-kanavien toiminnan estäminen farmakologisesti tai geneettisesti (engl. short hairpin RNA, shRNA) vähensi merkittävästi fagosytoosin tehokkuutta. Lisäksi näiden kanavien havaittiin paikantuvan sekä apikaalipinnalle muodostuviin fagosytoosi-kuppeihin, että jo sisään otettuihin fagosomeihin yhdessä endosomien markkeriproteiinien (engl. rat sarcoma virus-related protein, Rab7) kanssa. Nämä tulokset antavat viitteitä siitä, että NaV-kanavilla olisi monipuolisia tehtäviä fagosytoosin aikana.
NaV-kanavien lisäksi myös Cx43:n havaittiin esiintyvän näköaistinsolujen kalvopartikkelien kanssa fagosytoosissa ja tulokset antavat viitteitä siitä, että aukkoliitoksia otetaan solujen sisälle prosessin aikana. Fosforylaation havaittiin säätelevän tätä aukkoliitosten siirtymää ja erityisesti Cdk5-, ja proteiinikinaasi C- entsyymeillä oli merkittävä rooli tässä säätelyssä. Tämän työn tulokset osoittivat, että Cx43 liittyy fagosytoosikuppien muodostukseen sekä solujen aktiini-tukirangan uudelleen järjestymiseen. Fagosytoosin säätelyn tiedetään perustuvan vuorokausirytmiin ja mielenkiintoista on, että Cdk5-kinaasin on osoitettu vaikuttavan tähän rytmiin. On siis mahdollista, että Cdk5 auttaa myös fagosytoosin ajoituksen säätelyssä.
Kokonaisuutena työni osoittaa RPE:n fysiologian ja sen ionikanavakoneiston säätelyn monimutkaisuuden. Nav-kanavien roolin on havaittu olevan huomattavasti monipuolisempi kuin aktiopotentiaalien muodostus hermosoluissa ja tuloksemme vahvistavat tätä käsitystä. Yksi työni yllättävimmistä ja merkittävimmistä tuloksista oli, että RPE voi säädellä kalvojännitettään ja epiteelikudoksen solujen välistä viestintäänsä nopeasti. Tarkemmat tiedot tämän ionisignaloinnin roolista fagosytoosissa lisäävät ymmärrystämme prosessista, joka on merkittävä näkökyvyllemme. Yhteenvetona tämä työ osoittaa, että RPE:n rooli yhteistyössä verkkokalvon kanssa on paljon aktiivisempi kuin on aikaisemmin luultu.
Kokoelmat
- Väitöskirjat [4769]