Setting up Methods for the Study of Intracellular Mechanotransduction
HAMMAREN, HENRIK (2012)
HAMMAREN, HENRIK
2012
Biokemia - Biochemistry
Biolääketieteellisen teknologian yksikkö - Institute of Biomedical Technology
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Hyväksymispäivämäärä
2012-03-07
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/urn:nbn:fi:uta-1-22235
https://urn.fi/urn:nbn:fi:uta-1-22235
Tiivistelmä
Fokaaliadheesiot (FA) ovat suuria proteiinikomplekseja, joiden avulla solut tarttuvat ympäristönsä solunulkoiseen matriksiin liittämällä sen mekaanisesti solunsisäiseen tukirankaansa. FA:t ovat mekanosensorisia rakenteita, joilla solut aistivat ympäris-tönsä mekaanisia ominaisuuksia. Vaikka suurin osa tärkeimmistä FA-proteiineista on tunnettu jo pitkään, niiden toimintaa ja vuorovaikutuksia on alettu ymmärtää vasta hiljattain. Yksi ehdotetuista mekanosensorisista kokonaisuuksista FA:issa on taliini–vinkuliini-vuorovaikutus. Taliini on suurehko proteiini, joka muodostaa linkin solukalvossa sijaitsevien integriinien ja solutukirangan aktiinisäikeiden välille. Taliinin mekanosensoristen ominaisuuksien on ehdotettu johtuvan proteiinin rakenteen osittaisesta epälaskostumisesta, joka voiman vaikutuksen alaisena voisi johtaa aiemmin suljettujen (nk. kryptisten) vinkuliininsitomispaikkojen aukeamiseen. Tämä Pro Gradu -tutkielma kuvaa mekanotransduktion tutkimiseen hiiren alkion fibroblastisoluissa tarvittavan metodologian pystytyksen. Tutkimuksissa soluihin transfektoidaan vihreän fluoresoivan proteiinin (EGFP) ja Strep-Tag-puhdistuskahvan (ST) kanssa yhteen liitetty vinkuliinirakenne (EGFP-Vinkuliini-ST), joka mahdollistaa adheesioiden visualisoinnin fluoresenssimikroskopialla sekä FA-proteiinikompleksien affiniteettipuhdistuksen. Transfektion optimointi kuvataan ja kationisen polymeeripohjaisen transfektioreagenssin, TurboFect:n, osoitetaan olevan paras vaihtoehto tulevia kokeita ajatellen. Solujen ympäristön mekaanisten ominaisuuksien muuttamiseksi käytetään polyakryyliamidigeelikasvatusalustoja, joiden valmistus ja käyttö esitellään. Erijäykkyisten alustojen vaikutuksia tutkitaan puoliautomatisoidulla kuva-analyysillä, jota käyttäen solujen sekä adheesioiden pinta-alan näytetään kasvavan odotetulla tavalla pinnan jäykkyyden kasvaessa. Solujen pinta-ala-analyysissä nähdään myös, että vinkuliinia sisältämättömien MEF(Vin-/-)-solujen fenotyyppi ei ole täysin pelastettavissa transfektoimalla EGFP-Vinkuliini-ST:a soluihin. Tämän odottamattoman tuloksen syitä pohditaan aiemmin julkaistun kirjallisuuden valossa. Lisäksi esitellään FA-proteiinikompleksien puhdistukseen käytettäviä menetelmiä pitäen painopisteenä kemiallisia ristisitojia hyödyntävät fysikaaliset ja affiniteettipuhdistuspohjaiset menetelmät, joista ainakin jälkimmäisellä saadaan onnistuneesti puhdistettua EGFP-Vinkuliini-ST:a sekä pieniä määriä solun omaa vinkuliinia ja taliinia. Nämä kokeet luovat pohjan tuleville mekanotransduktiotutkimuksille biologisesti relevanteissa ympäristöissä ja ne ovat siten tärkeä askel kohti fokaaliadheesioiden mekanosensoristen ominaisuuksien molekyylitason ymmärtämistä.
Asiasanat:mekanoaistiminen, mekanotransduktio, fokaaliadheesiot, taliini, vinkuliini, hiiren alkion fibroblastit, polyakryyliamidigeeli solujen kasvatusalustana mechanosensing, mechanotransduction, focal adhesions, talin, vinculin, mouse embryonic fibroblasts, polyacrylamide gel cell culture substrates
Asiasanat:mekanoaistiminen, mekanotransduktio, fokaaliadheesiot, taliini, vinkuliini, hiiren alkion fibroblastit, polyakryyliamidigeeli solujen kasvatusalustana mechanosensing, mechanotransduction, focal adhesions, talin, vinculin, mouse embryonic fibroblasts, polyacrylamide gel cell culture substrates