Clostridium butyricum:n 1,3-propaanidiolioperonin promoottorin kloonaus ja säätelyn toiminta Escherichia coli:ssa ja Bacillus subtilis:ssa
LILJEROOS, LASSI (2008)
LILJEROOS, LASSI
2008
Biokemia - Biochemistry
Lääketieteellinen tiedekunta - Faculty of Medicine
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Hyväksymispäivämäärä
2008-05-14
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/urn:nbn:fi:uta-1-18127
https://urn.fi/urn:nbn:fi:uta-1-18127
Tiivistelmä
Tutkimuksen tausta ja tavoitteet
Vetyä pidetään ympäristöystävällisyytensä vuoksi yhtenä tulevaisuuden polttoaineista. Sen ympäristöystävällisyys riippuu kuitenkin tuotantotavoista, jotka nykyisellään eivät ole ekologisesti kestäviä. Biologinen vedyntuotto tarjoaa mahdollisuuden tuottaa vetyä uusiutuvista energianlähteistä kuten auringonvalosta ja biojätteestä. Biologinen vedyntuotto ei kuitenkaan toistaiseksi ole taloudellisesti kannattavaa, joten tuottoa pyritään parantamaan geneettisellä muokkauksella. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli kloonata pimeäfermentatiivisen vedyntuottajan Clostridium butyricum:n vedyntuottoon liittyvän 1,3-propaanidiolioperonin promoottori säätelytekijöineen ja tutkia sen toimintaa E. coli:ssa ja B. subtilis:ssa.
Tutkimusmenetelmät
Kloonauksissa käytettiin molekyylibiologian yleisiä työmenetelmiä. Promoottorin säätelyä tutkittiin lusiferaasireportterin avulla. Kokeet toteutettiin lisäämällä solukasvatuksiin oletettuja indusoreita glyserolia sekä 1,3-propaanidiolia ja seuraamalla tuotetun lusiferaasin määrää luminesenssimittauksin.
Tutkimustulokset
Promoottori säätelytekijöineen saatiin kloonattua ja E. coli sekä B. subtilis transformoitua rakennetulla vektorilla. Promoottori osoittautui molemmissa lajeissa aktiiviseksi, mutta glyserolilla tai 1,3-propaanidiolilla ei havaittu olevan merkittävää vaikutusta sen aktiivisuuteen.
Tulosten tarkastelu
Aiempien tutkimusten perusteella oletettiin, että 1,3-propaanidiolioperonin transkriptio on ylävirran kahden komponentin signaalinvälitysjärjestelmän säätelyn alaista. Hypoteesina oli, että transkriptio indusoituu glyserolin tai 1,3-propaanidiolin sitoutuessa sensoriproteiiniin. E. coli:ssa ja B. subtilis:ssa näin ei kuitenkaan todettu tapahtuvan. Tämä saattaa johtua signaalinvälitysjärjestelmän virheellisestä toiminnasta näissä lajeissa. On myös mahdollista, että sensori tunnistaa jonkin muun C. butyricum:n glyseroliaineenvaihdunnalle ominaisen tekijän kuin itse glyserolin tai 1,3-propaanidiolin, ja saadut tulokset johtuvat kyseisen tekijän puuttumisesta tutkituissa lajeissa.
Johtopäätökset
C. butyricum:n 1,3-propaanidiolioperonin promoottorin ei todettu aktivoituvan glyserolilla tai 1,3-propaanidiolilla E. coli:ssa tai B. subtilis:ssa. Luotettavamman tiedon promoottorin säätelystä saamiseksi olisi pyrittävä tutkimaan sen toimintaa jossakin C. butyricum:n lähisukulaislajissa kuten C. acetobutylicum:ssa.
Asiasanat: 1,3-propaanidioli, biodiesel, biologinen vedyntuotto, Clostridium butyricum, lusiferaasi
Vetyä pidetään ympäristöystävällisyytensä vuoksi yhtenä tulevaisuuden polttoaineista. Sen ympäristöystävällisyys riippuu kuitenkin tuotantotavoista, jotka nykyisellään eivät ole ekologisesti kestäviä. Biologinen vedyntuotto tarjoaa mahdollisuuden tuottaa vetyä uusiutuvista energianlähteistä kuten auringonvalosta ja biojätteestä. Biologinen vedyntuotto ei kuitenkaan toistaiseksi ole taloudellisesti kannattavaa, joten tuottoa pyritään parantamaan geneettisellä muokkauksella. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli kloonata pimeäfermentatiivisen vedyntuottajan Clostridium butyricum:n vedyntuottoon liittyvän 1,3-propaanidiolioperonin promoottori säätelytekijöineen ja tutkia sen toimintaa E. coli:ssa ja B. subtilis:ssa.
Tutkimusmenetelmät
Kloonauksissa käytettiin molekyylibiologian yleisiä työmenetelmiä. Promoottorin säätelyä tutkittiin lusiferaasireportterin avulla. Kokeet toteutettiin lisäämällä solukasvatuksiin oletettuja indusoreita glyserolia sekä 1,3-propaanidiolia ja seuraamalla tuotetun lusiferaasin määrää luminesenssimittauksin.
Tutkimustulokset
Promoottori säätelytekijöineen saatiin kloonattua ja E. coli sekä B. subtilis transformoitua rakennetulla vektorilla. Promoottori osoittautui molemmissa lajeissa aktiiviseksi, mutta glyserolilla tai 1,3-propaanidiolilla ei havaittu olevan merkittävää vaikutusta sen aktiivisuuteen.
Tulosten tarkastelu
Aiempien tutkimusten perusteella oletettiin, että 1,3-propaanidiolioperonin transkriptio on ylävirran kahden komponentin signaalinvälitysjärjestelmän säätelyn alaista. Hypoteesina oli, että transkriptio indusoituu glyserolin tai 1,3-propaanidiolin sitoutuessa sensoriproteiiniin. E. coli:ssa ja B. subtilis:ssa näin ei kuitenkaan todettu tapahtuvan. Tämä saattaa johtua signaalinvälitysjärjestelmän virheellisestä toiminnasta näissä lajeissa. On myös mahdollista, että sensori tunnistaa jonkin muun C. butyricum:n glyseroliaineenvaihdunnalle ominaisen tekijän kuin itse glyserolin tai 1,3-propaanidiolin, ja saadut tulokset johtuvat kyseisen tekijän puuttumisesta tutkituissa lajeissa.
Johtopäätökset
C. butyricum:n 1,3-propaanidiolioperonin promoottorin ei todettu aktivoituvan glyserolilla tai 1,3-propaanidiolilla E. coli:ssa tai B. subtilis:ssa. Luotettavamman tiedon promoottorin säätelystä saamiseksi olisi pyrittävä tutkimaan sen toimintaa jossakin C. butyricum:n lähisukulaislajissa kuten C. acetobutylicum:ssa.
Asiasanat: 1,3-propaanidioli, biodiesel, biologinen vedyntuotto, Clostridium butyricum, lusiferaasi