Peptidase Inhibitor 15 as a potential target of miR-32 and functional consequences of PI15 overexpression to PC-3 prostate cancer cell line
Kukkonen, Konsta (2016)
Kukkonen, Konsta
2016
Bioteknologian tutkinto-ohjelma - Degree Programme in Biotechnology
BioMediTech - BioMediTech
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Hyväksymispäivämäärä
2016-09-01
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:uta-201609082253
https://urn.fi/URN:NBN:fi:uta-201609082253
Tiivistelmä
Eturauhassyöpä on miesten yleisin syöpä länsimaissa. Syövän vaarallisuuden määrää suurelta osin sen kyky tunkeutua ympäröivään kudokseen ja lähettää etäispesäkkeitä. Eturauhassyövän leviämiseen ja metastaasiin johtavat molekulaariset mekanismit tunnetaan kuitenkin yhä suurelta osin heikosti. Nämä mekanismit täytyy tuntea, jotta voidaan löytää uusia apuvälineitä eturauhassyövän diagnosointiin ja tarkemman ennusteen tekemiseen sekä suunnitella parempia terapioita syövän leviämisen pysäyttämiseksi.
Tässä työssä tutkittiin pitkälle edenneessä syövässä yli-ilmentyvän androgeenireseptorin säätelemän mikroRNA:n, miR-32:n, vaikutusta peptidaasi-inhibiittori 15:n (PI15) ilmentymiseen eturauhassyövän solulinjoissa PC-3 ja LNCaP. Tämä miRNA kohdegeeni-pari herätti kiinnostuksen, sillä kastraatioresistentit syövät ovat tyypillisesti hyvin aggressiivisia ja peptidaaseilla ja proteaaseilla, joita PI15 inhiboi, on tähän suuri vaikutus. Hypoteesina on, että pitkälle edenneessä syövässä miR-32 vaimentaa PI15:n ilmentymisen, jolloin peptidaasien toiminta on aktiivisempaa ja syövän leviäminen kiihtynyttä.
Edellä mainittuja solulinjoja transfektoitiin PI15 geenin sisältävällä plasmidilla saman aikaisesti pre- miR-32:lla ja vaikutuksia PI15:n ilmentymiseen mitattiin qRT-PCR:lla ja western blot-menetelmällä. Lisäksi tehtiin reportterivektori, jossa lusiferaasi-geeni kytkettiin PI15:n 3' säätelyalueeseen, jolloin voidaan mitata miR-32:n säätelyvaikutusta lusiferaasin ilmentymiseen suoraan proteiinitasolla. Myös PI15:n yli-ilmentämisen vaikutuksia tutkittiin kloonaamalla PI15 geenin koodaava alue uuteen plasmidiin, jossa on nisäkässoluissa toimiva selektiogeeni, ja transfektoimalla PC-3 solulinja pysyvästi hyödyntäen antibiootin aikaan saamaa selektiopainetta. Näin saatujen PI15:ttä stabiilisti yli-ilmentävien PC-3 kloonien kasvunopeutta ja solujen elinkelpoisuutta mitattiin verrattuna tyhjällä plasmidilla transfektoituihin klooneihin.
PI15:n ja miR-32:n yhtäaikaisen transfektion aiheuttama hajonta osoittautui liian suureksi pitävien johtopäätösten tekemiseksi miR-32:n vaikutuksesta PI15:n ilmentymiseen. Tulevaisuudessa tehtävä lusiferaasi-reportterikoe voisi vastata paremmin tähän kysymykseen. PI15:n ilmentymistä ei tämän työn puitteissa kyetty todentamaan proteiinitasolla. Geenin yli-ilmentäminen kuitenkin johti selvästi alentuneeseen kasvunopeuteen ja solujen elinkelpoisuuteen sekä fenotyypin muuttumiseen suurimmalla ilmentämisen tasolla. Jatkotutkimusta vaaditaan, jotta voidaan osoittaa PI15 proteiinin aikaan saavan nämä muutokset.
Tässä työssä tutkittiin pitkälle edenneessä syövässä yli-ilmentyvän androgeenireseptorin säätelemän mikroRNA:n, miR-32:n, vaikutusta peptidaasi-inhibiittori 15:n (PI15) ilmentymiseen eturauhassyövän solulinjoissa PC-3 ja LNCaP. Tämä miRNA kohdegeeni-pari herätti kiinnostuksen, sillä kastraatioresistentit syövät ovat tyypillisesti hyvin aggressiivisia ja peptidaaseilla ja proteaaseilla, joita PI15 inhiboi, on tähän suuri vaikutus. Hypoteesina on, että pitkälle edenneessä syövässä miR-32 vaimentaa PI15:n ilmentymisen, jolloin peptidaasien toiminta on aktiivisempaa ja syövän leviäminen kiihtynyttä.
Edellä mainittuja solulinjoja transfektoitiin PI15 geenin sisältävällä plasmidilla saman aikaisesti pre- miR-32:lla ja vaikutuksia PI15:n ilmentymiseen mitattiin qRT-PCR:lla ja western blot-menetelmällä. Lisäksi tehtiin reportterivektori, jossa lusiferaasi-geeni kytkettiin PI15:n 3' säätelyalueeseen, jolloin voidaan mitata miR-32:n säätelyvaikutusta lusiferaasin ilmentymiseen suoraan proteiinitasolla. Myös PI15:n yli-ilmentämisen vaikutuksia tutkittiin kloonaamalla PI15 geenin koodaava alue uuteen plasmidiin, jossa on nisäkässoluissa toimiva selektiogeeni, ja transfektoimalla PC-3 solulinja pysyvästi hyödyntäen antibiootin aikaan saamaa selektiopainetta. Näin saatujen PI15:ttä stabiilisti yli-ilmentävien PC-3 kloonien kasvunopeutta ja solujen elinkelpoisuutta mitattiin verrattuna tyhjällä plasmidilla transfektoituihin klooneihin.
PI15:n ja miR-32:n yhtäaikaisen transfektion aiheuttama hajonta osoittautui liian suureksi pitävien johtopäätösten tekemiseksi miR-32:n vaikutuksesta PI15:n ilmentymiseen. Tulevaisuudessa tehtävä lusiferaasi-reportterikoe voisi vastata paremmin tähän kysymykseen. PI15:n ilmentymistä ei tämän työn puitteissa kyetty todentamaan proteiinitasolla. Geenin yli-ilmentäminen kuitenkin johti selvästi alentuneeseen kasvunopeuteen ja solujen elinkelpoisuuteen sekä fenotyypin muuttumiseen suurimmalla ilmentämisen tasolla. Jatkotutkimusta vaaditaan, jotta voidaan osoittaa PI15 proteiinin aikaan saavan nämä muutokset.