Enhancement of thermophilic dark fermentative hydrogen production and the use of molecular biology methods for bioprocess monitoring
Okonkwo, Onyinye Jeneth (2019)
Okonkwo, Onyinye Jeneth
Tampere University, Université Paris-Est
2019
Doctoral Programme in Advanced Biological Waste-to-Energy Technologies
Tekniikan ja luonnontieteiden tiedekunta - Faculty of Engineering and Natural Sciences
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Väitöspäivä
2019-12-12
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tuni-202001151266
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tuni-202001151266
Tiivistelmä
Pimeäfermentaation avulla orgaanisista jätemateriaaleista voidaan tuottaa biologisesti vetyä mahdollistaen samanaikainen jätteiden käsittely ja energiatuotanto. Pimeäfermentatiivisen vedyntuotannon mahdollistamiseksi teollisessa mittakaavassa prosessin tehokkuutta ja vedyntuotannon vakautta pitää kuitenkin vielä parantaa. Tämän työn tavoitteena oli tehostaa termofiilista vedyntuotantoa lisäämällä vetyä tuottaviin sekaviljelmiin tunnettuja vedyntuottajaorganismeja (bioaugmentointi) ja hyödyntämällä kahden vedyntuottajamikrobin muodostamia synteettisiä yhteisviljelmiä. Lisäksi pyrittiin lisäämään ymmärrystä vedyn tuotantoprosessin mikrobiyhteisöjen dynamiikasta erityisesti mahdollisissa häiriötilanteissa, jotka voivat johtaa nopeisiin lämpötilamuutoksiin tai kohonneeseen kuormitukseen.
Lyhytaikaisten lämpötilavaihtelujen vaikutusta vedyntuotantoon ja mikrobiyhteisön koostumukseen tutkittiin panoskokeissa, joissa 55 °C:ssa kasvatetun sekaviljelmän kasvatuslämpötilaa muutettiin äkillisesti joko kylmemmäksi (35 tai 45 °C) tai lämpimämmäksi (65 tai 75 °C) 48 tunnin ajaksi. Tämän jälkeen kaikki viljelmät palautettiin 55 °C:een ja niitä kasvatettiin vielä kahden peräkkäisen 48 tunnin panossyklin ajan. Tulokset osoittivat, että kaikki tutkitut äkilliset, lyhytaikaiset lämpötilamuutokset pienensivät vetysaantoja ja aiheuttivat muutoksia mikrobiyhteisön koostumuksessa verrattuna kontrolliviljelmään, jota kasvatettiin koko ajan panosviljelmänä 55 °C:ssa. Sekaviljelmissä, jotka altistettiin alhaisemmille lämpötiloille (35 ja 45 °C), palautuivat lämpötilamuutoksesta suhteellisen hyvin ja näiden viljelmien tuottama vetysaanto oli 55 °C:een palauttamisen jälkeen lähes yhtä korkea (92-96 %) kuin vakiolämpötilassa kasvatetun kontrolliviljelmän keskimääräinen vetysaanto. Altistuminen korkeammille lämpötiloille (65 ja 75 °C) vaikutti matalia lämpötiloja merkittävämmin vetysaantoihin, sillä näiden viljelmien tuottama vetysaanto oli 55 °C:een palauttamisen jälkeen vain 54-79% kontrolliviljelmän keskimääräisestä vetysaannosta.
Koska kasvatuslämpötilan äkillisen nousun osoitettiin johtavan mikrobiyhteisön moni-muotoisuuden vähenemiseen, tutkimuksen seuraavassa vaiheessa pyrittiin vedyntuottoa tehostamaan lämpötilavaihtelujen aikana ja nopeuttamaan vedyntuotannon palautumista lämpötilamuutosten jälkeen bioaugmentoinnin avulla. Sekaviljelmiin, joita altistettiin lämpötila-vaihteluille, lisättiin tunnettuja vedyntuottajamikrobeja (Thermotoga, Thermoanaerobacter, Thermoanaerobacterium, Caldicellulosiruptor ja Thermocellum spp.) joko lämpötilamuutoksen aikana tai sen jälkeen. Näiden mikrobien lisääminen sekaviljelmään tehosti vedyntuotantoa niin lämpötilamuutosten aikana kuin niiden jälkeenkin. Bioaugmentointi lämpötilamuutoksen aikana kuitenkin altisti myös bioaugmentoinnissa hyödynnetyt mikrobit lämpötilamuutoksille, mikä hiukan vähensi bioaugmentoinnin vedyntuottoa tehostavaa vaikutusta suhteessa lämpötilavaihtelun jälkeen tehtyyn bioaugmentointiin.
Seuraavissa panoskokeissa tutkittiin vedyntuotantoa hyödyntäen kahta erilaista vedyntuottajamikrobia, Caldicellulosiruptor saccharolyticus ja Thermotoga neapolitana, sekä niiden yhteisviljelmää. Yhteisviljelmällä saavutettiin suurin vetysaanto (2,8 ± 0,1 mol-H2/mol-glukoosia), joka oli 3,3 % korkeampi kuin C. saccharolyticus puhdasviljelmän vetysaanto ja 12 % korkeampi kuin T. neapolitana puhdasviljelmän vetysaanto. Lisäksi tämän kokeen yhteydessä kehitettiin kvantitatiiviseen polymeraasiketjureaktioon (qPCR) perustuva menetelmä T. neapolitana:n kasvun seuraamiseksi sekaviljelmissä. Menetelmän avulla varmistettiin, että T. neapolitana oli metabolisesti aktiivinen synteettisessä yhteisviljelmässä.
Kohonneen kuormituksen vaikutusta vedyntuottoon termofiilisellä sekaviljelmällä ja T. neapolitana:lla bioaugmentoidulla sekaviljelmällä tutkittiin nostamalla käytettävää glukoosi-pitoisuutta asteittain 5,5 mmol/L:sta 110 mmol/L:iin. Molemmilla viljelmillä glukoosipitoisuuden nostaminen laski vetysaantoa, mutta bioaugmentoidulla viljelmällä saavutettiin suuremmat vetysaannot lähes kaikilla tutkituilla glukoosipitoisuuksilla. T. neapolitana:n geenikopioiden määrä bioaugmentoidussa viljelmässä qPCR:llä mitattuna oli suurin korkeimmilla glukoosipitoisuuksilla. Tulokset siis osoittivat, että yhden mikrobin lisääminen viljelmään voi tehostaa sekaviljelmän vedyntuottoa.
Tässä työssä korkein vetysaanto saavutettiin synteettisellä yhteisviljelmällä (Caldicellulosiruptor saccharolyticus ja Thermotoga neapolitana). On kuitenkin syytä huomioida, että kasvatusolosuhteet tämän työn eri panoskokeissa poikkesivat toisistaan, eivätkä tulokset siis ole täysin vertailtavissa. Yhteenvetona voidaan kuitenkin todeta, että tämän työn perusteella synteettiset yhteisviljelmät ja bioaugmentointi ovat lupaavia tapoja tehostaa termofiilista pimeäfermentatiivista vedyntuotantoa. Molekyylibiologiset menetelmät kuten qPCR ja suurimittakaavainen DNA-luenta myös lisäsivät ymmärrystä eri mikrobilajien roolista sekaviljelmissä ja mikrobiyhteisöjen muutoksista simuloiduissa häiriötilanteissa. Molekyylibiologisten menetelmien hyödyntämien bioprosessien seurannassa onkin tärkeää, koska ne auttavat luomaan yhteyden mikrobiyhteisöjen koostumuksen ja mitatun vedyntuoton välille.
Lyhytaikaisten lämpötilavaihtelujen vaikutusta vedyntuotantoon ja mikrobiyhteisön koostumukseen tutkittiin panoskokeissa, joissa 55 °C:ssa kasvatetun sekaviljelmän kasvatuslämpötilaa muutettiin äkillisesti joko kylmemmäksi (35 tai 45 °C) tai lämpimämmäksi (65 tai 75 °C) 48 tunnin ajaksi. Tämän jälkeen kaikki viljelmät palautettiin 55 °C:een ja niitä kasvatettiin vielä kahden peräkkäisen 48 tunnin panossyklin ajan. Tulokset osoittivat, että kaikki tutkitut äkilliset, lyhytaikaiset lämpötilamuutokset pienensivät vetysaantoja ja aiheuttivat muutoksia mikrobiyhteisön koostumuksessa verrattuna kontrolliviljelmään, jota kasvatettiin koko ajan panosviljelmänä 55 °C:ssa. Sekaviljelmissä, jotka altistettiin alhaisemmille lämpötiloille (35 ja 45 °C), palautuivat lämpötilamuutoksesta suhteellisen hyvin ja näiden viljelmien tuottama vetysaanto oli 55 °C:een palauttamisen jälkeen lähes yhtä korkea (92-96 %) kuin vakiolämpötilassa kasvatetun kontrolliviljelmän keskimääräinen vetysaanto. Altistuminen korkeammille lämpötiloille (65 ja 75 °C) vaikutti matalia lämpötiloja merkittävämmin vetysaantoihin, sillä näiden viljelmien tuottama vetysaanto oli 55 °C:een palauttamisen jälkeen vain 54-79% kontrolliviljelmän keskimääräisestä vetysaannosta.
Koska kasvatuslämpötilan äkillisen nousun osoitettiin johtavan mikrobiyhteisön moni-muotoisuuden vähenemiseen, tutkimuksen seuraavassa vaiheessa pyrittiin vedyntuottoa tehostamaan lämpötilavaihtelujen aikana ja nopeuttamaan vedyntuotannon palautumista lämpötilamuutosten jälkeen bioaugmentoinnin avulla. Sekaviljelmiin, joita altistettiin lämpötila-vaihteluille, lisättiin tunnettuja vedyntuottajamikrobeja (Thermotoga, Thermoanaerobacter, Thermoanaerobacterium, Caldicellulosiruptor ja Thermocellum spp.) joko lämpötilamuutoksen aikana tai sen jälkeen. Näiden mikrobien lisääminen sekaviljelmään tehosti vedyntuotantoa niin lämpötilamuutosten aikana kuin niiden jälkeenkin. Bioaugmentointi lämpötilamuutoksen aikana kuitenkin altisti myös bioaugmentoinnissa hyödynnetyt mikrobit lämpötilamuutoksille, mikä hiukan vähensi bioaugmentoinnin vedyntuottoa tehostavaa vaikutusta suhteessa lämpötilavaihtelun jälkeen tehtyyn bioaugmentointiin.
Seuraavissa panoskokeissa tutkittiin vedyntuotantoa hyödyntäen kahta erilaista vedyntuottajamikrobia, Caldicellulosiruptor saccharolyticus ja Thermotoga neapolitana, sekä niiden yhteisviljelmää. Yhteisviljelmällä saavutettiin suurin vetysaanto (2,8 ± 0,1 mol-H2/mol-glukoosia), joka oli 3,3 % korkeampi kuin C. saccharolyticus puhdasviljelmän vetysaanto ja 12 % korkeampi kuin T. neapolitana puhdasviljelmän vetysaanto. Lisäksi tämän kokeen yhteydessä kehitettiin kvantitatiiviseen polymeraasiketjureaktioon (qPCR) perustuva menetelmä T. neapolitana:n kasvun seuraamiseksi sekaviljelmissä. Menetelmän avulla varmistettiin, että T. neapolitana oli metabolisesti aktiivinen synteettisessä yhteisviljelmässä.
Kohonneen kuormituksen vaikutusta vedyntuottoon termofiilisellä sekaviljelmällä ja T. neapolitana:lla bioaugmentoidulla sekaviljelmällä tutkittiin nostamalla käytettävää glukoosi-pitoisuutta asteittain 5,5 mmol/L:sta 110 mmol/L:iin. Molemmilla viljelmillä glukoosipitoisuuden nostaminen laski vetysaantoa, mutta bioaugmentoidulla viljelmällä saavutettiin suuremmat vetysaannot lähes kaikilla tutkituilla glukoosipitoisuuksilla. T. neapolitana:n geenikopioiden määrä bioaugmentoidussa viljelmässä qPCR:llä mitattuna oli suurin korkeimmilla glukoosipitoisuuksilla. Tulokset siis osoittivat, että yhden mikrobin lisääminen viljelmään voi tehostaa sekaviljelmän vedyntuottoa.
Tässä työssä korkein vetysaanto saavutettiin synteettisellä yhteisviljelmällä (Caldicellulosiruptor saccharolyticus ja Thermotoga neapolitana). On kuitenkin syytä huomioida, että kasvatusolosuhteet tämän työn eri panoskokeissa poikkesivat toisistaan, eivätkä tulokset siis ole täysin vertailtavissa. Yhteenvetona voidaan kuitenkin todeta, että tämän työn perusteella synteettiset yhteisviljelmät ja bioaugmentointi ovat lupaavia tapoja tehostaa termofiilista pimeäfermentatiivista vedyntuotantoa. Molekyylibiologiset menetelmät kuten qPCR ja suurimittakaavainen DNA-luenta myös lisäsivät ymmärrystä eri mikrobilajien roolista sekaviljelmissä ja mikrobiyhteisöjen muutoksista simuloiduissa häiriötilanteissa. Molekyylibiologisten menetelmien hyödyntämien bioprosessien seurannassa onkin tärkeää, koska ne auttavat luomaan yhteyden mikrobiyhteisöjen koostumuksen ja mitatun vedyntuoton välille.
Kokoelmat
- Väitöskirjat [4776]