Laadunvalvontamenetelmän pystytys Novodiag-testikasetin primer mix -komponenteille
Kakko, Lauri (2019)
Kakko, Lauri
2019
All rights reserved. This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2019120123776
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2019120123776
Tiivistelmä
Tämän opinnäytetyön tarkoituksena oli kehittää laadunvalvontamenetelmä Mobidiag Oy:n Novodiag® Bacterial GE+ -testikasetin primer mix -komponenteille (alukesekoitus-komponentit). Novodiag Bacterial GE+ on automatisoitu geenimonistusmenetelmä (PCR) useiden patogeenisten gasteroenteriittiä aiheuttavien bakteerien tunnistukseen potilaan ulostenäytteestä. Primer mix sisältää testissä tunnistettavien bakteerien kohdegeenien aluk-keet ja kehitetyn menetelmän tarkoitus oli pystyä toteamaan kaikkien tarvittavien primer mix -komponenttien toiminta osana valmistettavan kasetin laadunvalvontaa. Kehitetyn menetel-män oli myös tarkoitus tuottaa kvantitatiivista ja hyvin toistettavissa olevaa tietoa primer mix -komponenttien toiminnasta eri tuotantoerissä.
Menetelmässä käytettiin SYBR® Green -pohjaista qPCR-sulamiskäyräanalyysiä. Työssä kehitettiin sopivat pitoisuudet käytetyille synteettisille gBlock®-DNA-templaateille ja toimiva qPCR-ohjelma. Myös alukkeiden valmistajan vaikutusta tutkittiin ja se koettiin vähäiseksi. Toimivien olosuhteiden löydyttyä tehtiin toistoja eri primer mix -erillä ja qPCR-laitteistoilla selvittämään normaalivaihtelun suuruutta, laadunvalvonnassa käytettävien hyväksyntärajo-jen asettamiseksi.
Työssä kehitettyä laadunvalvontamenetelmää suunniteltaessa keskityttiin siihen, että kaikki alukkeet tunnistetaan. Kehitetyllä menetelmällä pystyttiin onnistuneesti erottamaan kaikki Bacterial GE+ -testikasetissa käytössä olevat alukkeet. Kuitenkin qPCR-monistuksessa ha-vaittiin negatiivisten näytteiden epäspesifistä monistumista SYBR Green -detektiolla, joka menetelmänä poikkeaa lopullisen tuotteen spesifisestä koetin-detektiosta. Koska negatiivis-ten näytteiden monistuminen olisi vaikeuttanut laadunvalvontaa huomattavasti ja niiden erot-taminen varsinaisista kontaminaatioista olisi ollut vaikeaa, päätettiin ettei kehitettyä mene-telmää lopulta voida käyttää vakituisena laadunvalvontamenetelmänä.
Menetelmässä käytettiin SYBR® Green -pohjaista qPCR-sulamiskäyräanalyysiä. Työssä kehitettiin sopivat pitoisuudet käytetyille synteettisille gBlock®-DNA-templaateille ja toimiva qPCR-ohjelma. Myös alukkeiden valmistajan vaikutusta tutkittiin ja se koettiin vähäiseksi. Toimivien olosuhteiden löydyttyä tehtiin toistoja eri primer mix -erillä ja qPCR-laitteistoilla selvittämään normaalivaihtelun suuruutta, laadunvalvonnassa käytettävien hyväksyntärajo-jen asettamiseksi.
Työssä kehitettyä laadunvalvontamenetelmää suunniteltaessa keskityttiin siihen, että kaikki alukkeet tunnistetaan. Kehitetyllä menetelmällä pystyttiin onnistuneesti erottamaan kaikki Bacterial GE+ -testikasetissa käytössä olevat alukkeet. Kuitenkin qPCR-monistuksessa ha-vaittiin negatiivisten näytteiden epäspesifistä monistumista SYBR Green -detektiolla, joka menetelmänä poikkeaa lopullisen tuotteen spesifisestä koetin-detektiosta. Koska negatiivis-ten näytteiden monistuminen olisi vaikeuttanut laadunvalvontaa huomattavasti ja niiden erot-taminen varsinaisista kontaminaatioista olisi ollut vaikeaa, päätettiin ettei kehitettyä mene-telmää lopulta voida käyttää vakituisena laadunvalvontamenetelmänä.