A Real-Time PCR Method for the Detection of Greedy Scale (Hemiberlesia rapax)
Tukonen Pala, Irene (2019)
Tukonen Pala, Irene
2019
All rights reserved. This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2019111321133
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2019111321133
Tiivistelmä
Uudessa-Seelannissa tuholaisseurantaa toteutetaan manuaalisesti tarkkaillen hyönteisten populaatiokokoja hedelmätarhoissa. Tämä tapa vie aikaa, eivätkä tulokset välttämättä ole valideja, sillä suurin osa hyönteisistä on liikkuvia. DNA-jäljet, joita hyönteiset erittävät ympäristöön solujen ja kudosten muodossa, luovat mahdollisen vaihtoehtoisen menetelmän manuaaliselle seurannalle. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli kehittää reaaliaikainen PCR-metodi greedy scale -hyönteislajille, joka on suurtuholainen ja jota esiintyy kaupallisissa hedelmätarhoissa Uudessa-Seelannissa ja globaalisestikin.
Tutkimukseen kuului kohdegeenin, internal transcribed spacer (ITS2), valitseminen, lajispesifisten reaaliaikaisten PRC-alukkeiden ja sekvensointia varten olevien alukkeiden suunnittelu sekä optimaalisten PCR-olosuhteiden löytäminen Sybr Green -kemialla. Tämä projekti johdettiin ja rahoitettiin Eurofins Bay of Plenty -yrityksen puolesta ja työ suoritettiin Plant and Food Research -yrityksen tiloissa Uudessa-Seelannissa.
Reaaliaikaisen PCR-menetelmän kehitys greedy scale -hyönteislajin tunnistukseen onnistui. Tulokset analysoitiin tarkkailemalla Cq- ja monistusarvoja. Monistusarvoja, jotka olivat alle 1,4 (optimaali on 2), ja samankaltaisia arvoja näytteiden ja nollakontrollien välillä ei otettu huomioon tulosten arvioinnissa. Sulamiskäyräanalyysi suoritettiin jokaisen PCR-ajon jälkeen. Tällä varmistettiin, että vain kohdegeenin osuus monistui. ITS2-geenin sulamispiste on 85,7 ̊C. Metodin spesifisyyttä arvioitiin kokeilemalla metodin toimivuutta muilla hyönteislajeilla ja testaamalla myös toisella DNA-matriisilla. Metodi on erittäin spesifinen ja herkkä greedy scale -hyönteislajille sekä täyttää validointivaatimukset.
Tämä tutkimus oli soveltuvuusselvitys, jota tullaan käyttämään lähtökohtana tuholaisseurannan kehittämisen jatkotutkimuksille. Seuraava tavoite projektissa on suunnitella metodi, jolla voidaan tunnistaa useita tuholaisia hedelmätarhoista samanaikaisesti. Tämän lisäksi yhtenä tavoitteena on tutkia menetelmän soveltamista käytäntöön. Lopullinen päämäärä on menetelmän kaupallistaminen, jotta esimerkiksi viljelijät voisivat käyttää sitä pakkaamoissa uutena tuholaistorjuntamenetelmänä. In New Zealand, kiwifruit and avocado orchard pest monitoring is based on the manual counting of insects found on leaf samples. This work is time-consuming and the results can be variable due to the mobility of insects. Traces of cellular DNA that insects excrete into the environment provide an opportunity to disrupt the current manual inspection methods for pest monitoring. In this study, the goal was to develop a real-time PCR method for the detection of greedy scale (Hemiberlesia rapax) insect, that is a major pest found in commercial crops in New Zealand and globally.
Firstly, in this study, a target gene, internal transcribed spacer (ITS 2), was selected. Then species-specific real-time PCR primers and primers for sequencing purposes were designed, and finally the optimal PCR conditions were found using Sybr Green chemistry. This project was led and funded by Eurofins Bay of Plenty and the laboratory work was carried out in Plant & Food Research facilities in New Zealand.
Designing the novel real-time PCR method for the detection of greedy scale was successful. Results were analyzed by observing Cq and amplification values of replicate samples. Amplification values less than 1.4 (optimal 2) and sample values similar to non-template control samples were treated as outliers. Melting curve analysis was conducted after each run to assure that the target gene region was only amplified. The target ITS2 region has a melting temperature of 85.7 ̊C. Assay specificity was evaluated by testing the method against other insect pests and with different DNA matrix. The method resulted to be highly specific and sensitive for greedy scale, meeting the validation requirements.
This proof of concept study will be used as a platform for further studies of improving the pest monitoring method. The future studies would include designing a method to identify many pests found from orchards. Also, one aim is to study how the method would be applied in practice. The final goal would be to commercialize the method so that growers, for instance, could use it in packhouses as the new pest monitoring method.
Tutkimukseen kuului kohdegeenin, internal transcribed spacer (ITS2), valitseminen, lajispesifisten reaaliaikaisten PRC-alukkeiden ja sekvensointia varten olevien alukkeiden suunnittelu sekä optimaalisten PCR-olosuhteiden löytäminen Sybr Green -kemialla. Tämä projekti johdettiin ja rahoitettiin Eurofins Bay of Plenty -yrityksen puolesta ja työ suoritettiin Plant and Food Research -yrityksen tiloissa Uudessa-Seelannissa.
Reaaliaikaisen PCR-menetelmän kehitys greedy scale -hyönteislajin tunnistukseen onnistui. Tulokset analysoitiin tarkkailemalla Cq- ja monistusarvoja. Monistusarvoja, jotka olivat alle 1,4 (optimaali on 2), ja samankaltaisia arvoja näytteiden ja nollakontrollien välillä ei otettu huomioon tulosten arvioinnissa. Sulamiskäyräanalyysi suoritettiin jokaisen PCR-ajon jälkeen. Tällä varmistettiin, että vain kohdegeenin osuus monistui. ITS2-geenin sulamispiste on 85,7 ̊C. Metodin spesifisyyttä arvioitiin kokeilemalla metodin toimivuutta muilla hyönteislajeilla ja testaamalla myös toisella DNA-matriisilla. Metodi on erittäin spesifinen ja herkkä greedy scale -hyönteislajille sekä täyttää validointivaatimukset.
Tämä tutkimus oli soveltuvuusselvitys, jota tullaan käyttämään lähtökohtana tuholaisseurannan kehittämisen jatkotutkimuksille. Seuraava tavoite projektissa on suunnitella metodi, jolla voidaan tunnistaa useita tuholaisia hedelmätarhoista samanaikaisesti. Tämän lisäksi yhtenä tavoitteena on tutkia menetelmän soveltamista käytäntöön. Lopullinen päämäärä on menetelmän kaupallistaminen, jotta esimerkiksi viljelijät voisivat käyttää sitä pakkaamoissa uutena tuholaistorjuntamenetelmänä.
Firstly, in this study, a target gene, internal transcribed spacer (ITS 2), was selected. Then species-specific real-time PCR primers and primers for sequencing purposes were designed, and finally the optimal PCR conditions were found using Sybr Green chemistry. This project was led and funded by Eurofins Bay of Plenty and the laboratory work was carried out in Plant & Food Research facilities in New Zealand.
Designing the novel real-time PCR method for the detection of greedy scale was successful. Results were analyzed by observing Cq and amplification values of replicate samples. Amplification values less than 1.4 (optimal 2) and sample values similar to non-template control samples were treated as outliers. Melting curve analysis was conducted after each run to assure that the target gene region was only amplified. The target ITS2 region has a melting temperature of 85.7 ̊C. Assay specificity was evaluated by testing the method against other insect pests and with different DNA matrix. The method resulted to be highly specific and sensitive for greedy scale, meeting the validation requirements.
This proof of concept study will be used as a platform for further studies of improving the pest monitoring method. The future studies would include designing a method to identify many pests found from orchards. Also, one aim is to study how the method would be applied in practice. The final goal would be to commercialize the method so that growers, for instance, could use it in packhouses as the new pest monitoring method.