Narkolepsian ja ihmisen mikrobiomin mahdollisen yhteyden selvittäminen NGS-sekvensointikirjaston avulla
Ervasti, Sanna (2019)
Ervasti, Sanna
2019
All rights reserved. This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2019091018331
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2019091018331
Tiivistelmä
Opinnäytetyö tehtiin Helsingin yliopiston Biotekniikan instituutissa. Opinnäytetyö suoritettiin helsinkiläisen ja ranskalaisen tutkimusryhmän yhteistyöprojektina, jossa selvitettiin ulostenäytteitä tutkimalla mahdollista yhteyttä narkolepsian ja ihmisen mikrobiomin välillä. Tutkimuksessa oli mukana näytteitä narkolepsiaa sairastavilta henkilöiltä, näytteitä henkilöiltä, joilla oli todettu muunlaista hypersomniaa, ja näytteitä terveiltä henkilöiltä.
Biotekniikan instituutissa on aiemmin suoritettu Parkinsonin tautiin liittyvää tutkimusta, jossa on selvitetty Parkinsonin taudin ja ihmisen suoliston mikrobiomin välistä korrelaatiota. Tämän perusteella on todistettu, että ihmisen suoliston mikrobiomista löytyy eroavaisuuksia terveiden ja Parkinsonin tautia sairastavien henkilöiden välillä.
Projekti aloitettiin näytteiden lajittelulla ja merkitsemisellä, jonka jälkeen suoritettiin DNA:n eristäminen kaupallisen kitin protokollan mukaan. Eristetyille DNA-näytteille tehtiin kaksivaiheinen PCR, jossa ensimmäisessä vaiheessa rajattiin spesifisillä alukkeilla monistettava osa 16S-geenistä. Toisessa vaiheessa universaalit kaksoisindeksialukkeet tunnistivat ensimmäisen PCR:n sekvensointiadapterit, jolloin muodostui pidempi fragmentti ensimmäisen vaiheen PCR-tuotteesta. Kaksoisindeksialukkeiden avulla näytteet pystyttiin identifioimaan sekvensoinnin jälkeen. 16S NGS-sekvensointikirjastoa varten PCR-tuotteet yhdistettiin yhdeksi näytepooliksi. Näytepooli puhdistettiin, minkä jälkeen määritettiin DNA-fragmenttien pituus.
Lopuksi näytteistä valmistettiin 16S NGS-sekvensointikirjasto ja näytteiden sisältämät bakteerit pystyttiin tunnistamaan. Sekvensointi suoritettiin Illumina-sekvensointimenetelmällä, jossa halutusta geenialueesta saatiin monistettua tuhansia sekvenssejä myöhempää bioinformatiivista analysointia varten, jossa sekvenssejä verrataan tunnettuun genomiin. Tämän perusteella voidaan tutkia, löytyykö narkolepsiaa sairastavien ja terveiden henkilöiden suoliston mikrobiomien väliltä eroavaisuuksia.
Biotekniikan instituutissa on aiemmin suoritettu Parkinsonin tautiin liittyvää tutkimusta, jossa on selvitetty Parkinsonin taudin ja ihmisen suoliston mikrobiomin välistä korrelaatiota. Tämän perusteella on todistettu, että ihmisen suoliston mikrobiomista löytyy eroavaisuuksia terveiden ja Parkinsonin tautia sairastavien henkilöiden välillä.
Projekti aloitettiin näytteiden lajittelulla ja merkitsemisellä, jonka jälkeen suoritettiin DNA:n eristäminen kaupallisen kitin protokollan mukaan. Eristetyille DNA-näytteille tehtiin kaksivaiheinen PCR, jossa ensimmäisessä vaiheessa rajattiin spesifisillä alukkeilla monistettava osa 16S-geenistä. Toisessa vaiheessa universaalit kaksoisindeksialukkeet tunnistivat ensimmäisen PCR:n sekvensointiadapterit, jolloin muodostui pidempi fragmentti ensimmäisen vaiheen PCR-tuotteesta. Kaksoisindeksialukkeiden avulla näytteet pystyttiin identifioimaan sekvensoinnin jälkeen. 16S NGS-sekvensointikirjastoa varten PCR-tuotteet yhdistettiin yhdeksi näytepooliksi. Näytepooli puhdistettiin, minkä jälkeen määritettiin DNA-fragmenttien pituus.
Lopuksi näytteistä valmistettiin 16S NGS-sekvensointikirjasto ja näytteiden sisältämät bakteerit pystyttiin tunnistamaan. Sekvensointi suoritettiin Illumina-sekvensointimenetelmällä, jossa halutusta geenialueesta saatiin monistettua tuhansia sekvenssejä myöhempää bioinformatiivista analysointia varten, jossa sekvenssejä verrataan tunnettuun genomiin. Tämän perusteella voidaan tutkia, löytyykö narkolepsiaa sairastavien ja terveiden henkilöiden suoliston mikrobiomien väliltä eroavaisuuksia.