Reaaliaikaisen multiplex RT-PCR -menetelmän käyttöönotto ja validointi porcine reproductive and respiratory syndrome - virukselle
Kantola, Roosa (2018)
Kantola, Roosa
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2018
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2018112919127
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2018112919127
Tiivistelmä
Tämän opinnäytetyön tarkoituksena oli käyttöönottaa ja validoida tehokkaampi tutkimusmenetelmä porcine reproductive and respiratory syndrome -virukselle (PRRSV, sikojen lisääntymis- ja hengitystieoireyhtymävirus) entisen perinteisen PCR-menetelmän tilalle Elintarviketurvallisuusviraton (Evira) Virologian tutkimusyksikössä. Käyttöönotettu menetelmä oli reaaliaikainen multiplex RT-PCR -menetelmä, jolla voidaan todeta ja erottaa PRRS-viruksen eurooppalaista (EU) ja pohjoisamerikkalaista (NA) tyyppiä edustavat viruskannat yhtäaikaisesti.
Työ toteutettiin aiemmin julkaistun saksalaisen tutkimuksen pohjalta (Wernike, 2012a), jonka mukaan valittiin alukkeet, koettimet ja niiden pitoisuudet sekä PCR-ajo-ohjelma. Valitut alukkeet ja koettimet sekä PCR-ajo-ohjelma testattiin menetelmän käyttöönoton yhteydessä. Käyttöönoton jälkeen testi validoitiin.
Menetelmän testaus suoritettiin kumpaakin PRRS-viruksen tyyppiä (EU ja NA), edustavan prototyyppikannan laimennussarjoilla (10-1—10-8). Validointiin käytettiin kaupallista vuoden 2018 vertailututkimusnäytepaneelia, joka sisälsi PRRS-viruspositiivisia ja -negatiivisia sian seeruminäytteitä (n = 8). Lisäksi validoinnissa testattiin neljää eri matriisia, jotka olivat sian elinsuspensio, seerumi, siemenneste sekä soluviljelyelatusaine. Matriiseihin tehtiin laimennussarjat PRRS-viruksen molempia tyyppejä edustavista prototyyppikannoista ja kustakin laimennoksesta eristettiin virus-RNA. Näytteet analysoitiin käyttöönotetulla testillä.
Tuloksista määritettiin testin spesifisyys, sensitiivisyys, tarkkuus ja selektiivisyys, jotka todettiin erinomaiseksi. Toistettavuus määritettiin yhden henkilön kolmen toistokerran tuloksista lasketun variaatiokertoimen (CV %) avulla, kun taas uusittavuutta mitattiin kolmen eri henkilön toistojen tuloksista lasketun variaatiokertoimen avulla. Näillä parametreilla menetelmä todettiin toimivaksi ja validointi onnistuneeksi.
Työssä validoitu menetelmä lisätään Eviran Virologian tutkimusyksikön FINAS-akkreditoituihin reaaliaikaisiin multiplex RT-PCR -menetelmiin.
Työ toteutettiin aiemmin julkaistun saksalaisen tutkimuksen pohjalta (Wernike, 2012a), jonka mukaan valittiin alukkeet, koettimet ja niiden pitoisuudet sekä PCR-ajo-ohjelma. Valitut alukkeet ja koettimet sekä PCR-ajo-ohjelma testattiin menetelmän käyttöönoton yhteydessä. Käyttöönoton jälkeen testi validoitiin.
Menetelmän testaus suoritettiin kumpaakin PRRS-viruksen tyyppiä (EU ja NA), edustavan prototyyppikannan laimennussarjoilla (10-1—10-8). Validointiin käytettiin kaupallista vuoden 2018 vertailututkimusnäytepaneelia, joka sisälsi PRRS-viruspositiivisia ja -negatiivisia sian seeruminäytteitä (n = 8). Lisäksi validoinnissa testattiin neljää eri matriisia, jotka olivat sian elinsuspensio, seerumi, siemenneste sekä soluviljelyelatusaine. Matriiseihin tehtiin laimennussarjat PRRS-viruksen molempia tyyppejä edustavista prototyyppikannoista ja kustakin laimennoksesta eristettiin virus-RNA. Näytteet analysoitiin käyttöönotetulla testillä.
Tuloksista määritettiin testin spesifisyys, sensitiivisyys, tarkkuus ja selektiivisyys, jotka todettiin erinomaiseksi. Toistettavuus määritettiin yhden henkilön kolmen toistokerran tuloksista lasketun variaatiokertoimen (CV %) avulla, kun taas uusittavuutta mitattiin kolmen eri henkilön toistojen tuloksista lasketun variaatiokertoimen avulla. Näillä parametreilla menetelmä todettiin toimivaksi ja validointi onnistuneeksi.
Työssä validoitu menetelmä lisätään Eviran Virologian tutkimusyksikön FINAS-akkreditoituihin reaaliaikaisiin multiplex RT-PCR -menetelmiin.