Multiplex qPCR -menetelmän verifiointi hevosen herpesviruksen tyypeille 1 ja 4
Jokinen, Camilla (2018)
Jokinen, Camilla
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2018
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2018091715180
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2018091715180
Tiivistelmä
Tämän opinnäytetyön tarkoituksena ja tavoitteena oli käyttöönottaa perinteistä PCR -menetelmää nopeampi ja tehokkaampi kvantitatiivinen PCR- eli qPCR-menetelmä hevosen herpesvirustyypille 1 ja 4 (Equine Herpesvirus, EHV) Eviran eläinvirologian tutkimusyksikössä. qPCR-menetelmä toteutettiin multiplex-reaktiona eli molemmat virustyypit analysoitiin omien koettimien avulla samanaikaisesti. Materiaalina käytettiin EU-referenssilaboratoriosta (Anses) Ranskasta saatuja EHV-1- ja EHV-4-DNA-näytteitä, Duvaxyn-rokotesuspensiota, joka sisälsi molempia EHV-tyyppejä sekä EHV-1- ja EHV-4-viruskantoja (Kentucky VR700 ja Newmarket), joista tehtiin matriisilaimennossarjat 10-1 ‒ 10-7 hevosen elinsuspensioon, sierainlimaan sekä solujen elatusaineeseen. Menetelmän olosuhteiden optimointi suoritettiin 10-1 - 10-7 rokotesuspensiolaimennossarjalla. Toistettavuuden ja uusittavuuden määrittämiseksi testattiin matriisilaimennossarjat: elinsuspensio- ja elatusainelaimennossarjalla suoritettiin vähintään viisi sekä sierainlimalaimennossarjalla kaksi onnistunutta testauskertaa. Referenssilaboratorion DNA-näytteistä tehtiin laimennossarjat 10-1 - 10-3, joiden avulla määritettiin muun muassa menetelmän tarkkuus.
Tuloksien avulla määritettiin menetelmän objektiivinen tarkkuus, yhdenmukaisuus, spesifisyys, sensitiivisyys, toistettavuus, uusittavuus sekä PCR-tehokkuus. Tarkkuus ja yhdenmukaisuus saatiin referenssinäytteiden EHV-virustyyppikohtaisia tuloksia vertailemalla, sensitiivisyys ja spesifisyys määritettiin vertaamalla referenssinäytteiden tuloksia matriisilaimennossarjojen tuloksiin. Toistettavuus määritettiin yhden tekijän kolmen toiston tulosten variaatiokertoimista, kun taas uusittavuus määritettiin kolmen tekijän toistojen tulosten välisistä variaatiokertoimista. Kaikista muista verifioitavista parametreista, paitsi PCR-tehokkuudesta, saatiin hyvät tulokset. PCR-tehokkuus eri matriiseilla oli viitearvoja suurempi.
Menetelmän verifiointi todettiin onnistuneeksi ja se tullaan liittämään Eviran FINAS-akkreditoituihin qPCR-menetelmiin.
Tuloksien avulla määritettiin menetelmän objektiivinen tarkkuus, yhdenmukaisuus, spesifisyys, sensitiivisyys, toistettavuus, uusittavuus sekä PCR-tehokkuus. Tarkkuus ja yhdenmukaisuus saatiin referenssinäytteiden EHV-virustyyppikohtaisia tuloksia vertailemalla, sensitiivisyys ja spesifisyys määritettiin vertaamalla referenssinäytteiden tuloksia matriisilaimennossarjojen tuloksiin. Toistettavuus määritettiin yhden tekijän kolmen toiston tulosten variaatiokertoimista, kun taas uusittavuus määritettiin kolmen tekijän toistojen tulosten välisistä variaatiokertoimista. Kaikista muista verifioitavista parametreista, paitsi PCR-tehokkuudesta, saatiin hyvät tulokset. PCR-tehokkuus eri matriiseilla oli viitearvoja suurempi.
Menetelmän verifiointi todettiin onnistuneeksi ja se tullaan liittämään Eviran FINAS-akkreditoituihin qPCR-menetelmiin.