Pesäke-PCR-menetelmän optimointi : Gramnegatiiviset sauvabakteerit
Nikula, Iiris (2018)
Nikula, Iiris
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2018
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201804275748
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201804275748
Tiivistelmä
Opinnäytetyö tehtiin Helsingin yliopiston mikrobiologian osastolla kokeellisen evoluution tutkimusryhmässä. Opinnäytetyön tarkoituksena oli optimoida menetelmä, jossa PCR suoritetaan bakteeripesäkkeille ilman DNA-eristystä (pesäke-PCR). Optimointi suoritettiin selvittämällä soluliuoksen kolmessa lyysauspuskurissa keittämisen, sentrifugoinnin ja kahden polymeraasientsyymin vaikutus PCR:n tilastollisesti mallinnettuun onnistumistodennäköisyyteen.
Tutkimuksen näytemateriaalina oli kahdeksan bakteerikantaa Helsingin yliopiston HAMBI-kantakokoelmasta. Näytteet valittiin kiinnittämällä huomiota bakteerien kliiniseen merkitykseen. Kaikki tutkimukseen valitut kannat ovat gramnegatiivisia, opportunistisia sauvabakteereja.
Tutkimuksesta kävi ilmi, että PCR-tulokseen vaikutti voimakkaimmin näytteen esikäsittely: Positiivista PCR-tulosta ennusti parhaiten 20 mM NaOH:n käyttäminen lyysauspuskurina. Näytteen sentrifugoinnilla ei ollut tilastollisesti merkitsevää vaikutusta, mutta sentrifugointi johti suurempaan tuotemäärään. PCR-ohjelma, jossa oli käytössä DreamTaq-polymeraasientsyymi, tuotti Phusion-polymeraasientsyymiin verrattuna enemmän positiivisia PCR-tuloksia, mutta tuotti myös enemmän virheitä.
Tutkimuksen näytemateriaalina oli kahdeksan bakteerikantaa Helsingin yliopiston HAMBI-kantakokoelmasta. Näytteet valittiin kiinnittämällä huomiota bakteerien kliiniseen merkitykseen. Kaikki tutkimukseen valitut kannat ovat gramnegatiivisia, opportunistisia sauvabakteereja.
Tutkimuksesta kävi ilmi, että PCR-tulokseen vaikutti voimakkaimmin näytteen esikäsittely: Positiivista PCR-tulosta ennusti parhaiten 20 mM NaOH:n käyttäminen lyysauspuskurina. Näytteen sentrifugoinnilla ei ollut tilastollisesti merkitsevää vaikutusta, mutta sentrifugointi johti suurempaan tuotemäärään. PCR-ohjelma, jossa oli käytössä DreamTaq-polymeraasientsyymi, tuotti Phusion-polymeraasientsyymiin verrattuna enemmän positiivisia PCR-tuloksia, mutta tuotti myös enemmän virheitä.