Pikornavirusten tyypitys kliinisistä näytteistä RT-qPCR -menetelmällä
Nevalainen, Janne (2016)
Nevalainen, Janne
Turun ammattikorkeakoulu
2016
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2016061613066
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2016061613066
Tiivistelmä
Tämän opinnäytetyön tarkoituksena oli kehittää ja testata vuokaaviota, jonka avulla voidaan kliinisistä näytteistä tunnistaa ja tyypittää entero-, rino- tai parechoviruksia. Vuokaaviossa käytetään kvantitatiivista käänteiskopiointi-polymeraasiketjureaktio (RT-qPCR) -menetelmää. Erilaisia alukkeita ja ajo-ohjelmia käyttämällä virus tunnistetaan ja PCR-tuote sekvensoimalla ja analysoimalla saadaan selville kunkin pikornavirusnäytteen tyyppi. Työssä vertailtiin ensin virus-RNA:n eristysmenetelmiä käyttäen ns. ENRI-menetelmää ja tunnettuja enterovirusnäytteitä. Eristyskittejä vertailtiin RT-qPCR-laitteen antamaan Ct-arvoon perustuen ja sopivinta eristysmenetelmää käytettiin työssä. Työn aikana analysoitiin 71 kpl THL:n FinOM Cohort study -tutkimuksessa kerättyä näytettä, joiden oletettiin sisältävän virusta. Vuokaaviossa edettiin seuraavasti: Virus-RNA:t (vRNA) eristettiin ja ne analysoitiin ENRI-testillä. ENRI-testissä positiivisiksi osoittautuneet näytteet analysoitiin VP4/2-testillä rinovirusten tyypittämiseksi (ns. rinotyypitys) ja enterovirusten tunnistamiseksi. VP4/2-alueen sekvensointitulosten perusteella enteroviruksista tehtiin vielä VP1-testi (ns. enterotyypitys) sekvensoimalla VP1-alueesta tuotettu PCR-pala. ENRI-negatiiviset näytteet tutkittiin parechovirusten osalta ns. PAR-ENRI-testissä. PAR-ENRI:ssä positiivisen tuloksen tuottaneet näytteet tyypitettiin. Parechotyypitystestissä oikeankokoiset PCR-tuotteet lähetettiin sekvensoitavaksi. Sekvenssejä verrattiin geenipankin sekvensseihin ja lähin samankaltainen sekvenssi osoitti näytteen tyypin. Työn aikana saatiin tyypitettyä kaikki entero-, rino- ja parechovirus-positiiviset näytteet, joita oli yhteensä 28 kpl. Näytteistä kaksi tyypitettiin rinoviruksiksi, kuusi parechoviruksiksi ja loput 20 näytettä enteroviruksiksi.