Homogeenisen deasetylaatio-määritysmenetelmän kehittäminen tehoseulontaan
Hietala, Laura (2016)
Hietala, Laura
Turun ammattikorkeakoulu
2016
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201605259650
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201605259650
Tiivistelmä
Soluissa tapahtuvat proteiinin translaation jälkeiset muokkaukset ovat yksi tärkeimmistä säätelytekijöistä solujen välisessä viestinnässä. Näitä muokkauksia säätelee suuri määrä entsyymejä, jotka aikaansaavat muun muassa proteiinin asetylaation, fosforylaation, sulfonaation ja metylaation. Jos proteiinin translaation jälkeistä muokkausta ei säädellä, voi tuloksena olla solujen räjähdysmäinen kasvu, geenin ilmentyminen, solukuolema, useita sairauksia ja syöpiä. Jälkitranslaatio säätelee näiden entsyymien aktivointia ja inaktivointia.
Opinnäytetyössä kehitettiin ja optimoitiin homogeeninen, vasta-aineeton menetelmä deasetylaation säätelyyn peptidisubstraateilla. Menetelmässä hyödynnettiin soluissa syntyviä leusiinivetoketjuja. Leusiinivetoketju muodostuu, kun kaksi alfa-helikaalista aminohappoketjua, joissa joka seitsemäs aminohappo on leusiini, yhdistyvät. Leusiinivetoketjut ovat yksi yleisimmistä geenien säätelytekijöistä.
Yksi deasetylaation aikaansaava ihmisestä eristetty entsyymi on sirtuiini-ryhmään kuuluva Sirtuin 1. Sirtuin 1 on NAD(+) -riippuvainen entsyymi, joka poistaa peptidiketjusta asetaattiryhmän. Tehdyssä työssä asetaattiryhmä poistettiin entsymaattisesti substraattipeptidistä, jolloin leusiinivetoketju muodostuu europium-leimatun vastinpeptidin kanssa. Tämän johdosta saadaan suuri europium luminesenssisignaali kun pariutuva peptidirakenne suojelee europiumkelaattia sammutukselta. Reaktioon lisättiin liukoista sammutinmolekyyliä, Quench III:a, joka hiljentää europiumin signaalin, jos peptidipariutumista ei tapahdu entsymaattisen toiminnan inhiboituessa. Reaktiosta mitattiin aikaerotteista luminesenssia QRET-tekniikalla eli sammutus-resonanssienergiansiirrolla. Systeemin validoimiseksi reaktiolle mitattiin inhibiittorititrauksella IC50-arvo, jota verrattiin kirjallisuudessa ilmoitettuun arvoon.
Opinnäytetyössä kehitettiin ja optimoitiin homogeeninen, vasta-aineeton menetelmä deasetylaation säätelyyn peptidisubstraateilla. Menetelmässä hyödynnettiin soluissa syntyviä leusiinivetoketjuja. Leusiinivetoketju muodostuu, kun kaksi alfa-helikaalista aminohappoketjua, joissa joka seitsemäs aminohappo on leusiini, yhdistyvät. Leusiinivetoketjut ovat yksi yleisimmistä geenien säätelytekijöistä.
Yksi deasetylaation aikaansaava ihmisestä eristetty entsyymi on sirtuiini-ryhmään kuuluva Sirtuin 1. Sirtuin 1 on NAD(+) -riippuvainen entsyymi, joka poistaa peptidiketjusta asetaattiryhmän. Tehdyssä työssä asetaattiryhmä poistettiin entsymaattisesti substraattipeptidistä, jolloin leusiinivetoketju muodostuu europium-leimatun vastinpeptidin kanssa. Tämän johdosta saadaan suuri europium luminesenssisignaali kun pariutuva peptidirakenne suojelee europiumkelaattia sammutukselta. Reaktioon lisättiin liukoista sammutinmolekyyliä, Quench III:a, joka hiljentää europiumin signaalin, jos peptidipariutumista ei tapahdu entsymaattisen toiminnan inhiboituessa. Reaktiosta mitattiin aikaerotteista luminesenssia QRET-tekniikalla eli sammutus-resonanssienergiansiirrolla. Systeemin validoimiseksi reaktiolle mitattiin inhibiittorititrauksella IC50-arvo, jota verrattiin kirjallisuudessa ilmoitettuun arvoon.