Homogeenisen kinaasimääritysmenetelmän kehittäminen tehoseulontaan
Kuusisto, Tiina (2016)
Kuusisto, Tiina
Turun ammattikorkeakoulu
2016
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201605188416
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201605188416
Tiivistelmä
Opinnäytetyössä tutustutaan proteiinien jälkitranslationaalisiin muokkauksiin, joista keskitytään fosforylaatioon ja erityisesti defosforylaatioon. Tavoitteena on kehittää homogeeninen vastaaineeton entsyymiaktiivisuuden määritysmenetelmä, joka käyttää hyväkseen sammutusresonanssienergiansiirtotekniikkaa (QRET). Työssä sidottiin yhteen peptidisubstraatti sekä europium-leimattu peptidi leusiinivetoketjurakenteessa. Fosfaattiryhmän ollessa kiinni peptidisubstraatissa sidosta ei synny ja reaktioseokseen lisättävä liukoinen sammutin pääsee reagoimaan europiumin kanssa sammuttaen tämän signaalin. Fosfaattiryhmä saadaan poistettua fosfataasientsyymin avulla, jolloin substraatti ja Eu-peptidi pääsevät sitoutumaan toisiinsa. Sidos estää sammuttimen reagoinnin europiumin kanssa, jolloin sammutin ei pääse sammuttamaan signaalia, ja saadaan suuri signaali. Inhibiittoreilla saadaan estettyä entsyymin toimintaa, ja työssä testattiin fosfataasientsyymin PTP1B toimintaa estäviä entsyymejä. Inhibiittori sitoutuu entsyymin aktiiviseen kohtaan ja estää substraatin sitoutumisen entsyymiin; kyseessä siis kilpaileva esto. Mittaukset tehtiin mikrotiitterilevyformaatissa mittaamalla aikaerotteista luminesenssia.
Työssä etsittiin reaktioon sopivat substraatti-, Eu-peptidi- ja entsyymikonsentraatiot. Mitattiin entsyymikinetiikkaa ja määritettiin inhibiittorien IC50 –arvot. Lisäksi tehtiin kaksoismääritys kinaasientsyymeillä, joissa käytettiin kahta eri kinaasientsyymiä sekä näille spesifisiä peptidisubstraatteja sekä inhibiittoreita. Testattiin universaalia inhibiittoria, joka estää kummankin entsyymin toimintaa.
Työssä etsittiin reaktioon sopivat substraatti-, Eu-peptidi- ja entsyymikonsentraatiot. Mitattiin entsyymikinetiikkaa ja määritettiin inhibiittorien IC50 –arvot. Lisäksi tehtiin kaksoismääritys kinaasientsyymeillä, joissa käytettiin kahta eri kinaasientsyymiä sekä näille spesifisiä peptidisubstraatteja sekä inhibiittoreita. Testattiin universaalia inhibiittoria, joka estää kummankin entsyymin toimintaa.