Keliakian HLA-reseptoreiden tyypitys qPCR:llä
Mäkeläinen, Iida (2016)
Mäkeläinen, Iida
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2016
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201605076477
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201605076477
Tiivistelmä
Keliakia on perinnöllinen, yleensä suolistossa esiintyvä autoimmuunisairaus. Ravinnossa oleva gluteeni aiheuttaa elimistössä immuunipuolustusreaktion geneettisesti siihen alttiilla ihmisillä. Gluteeni pääsee ohutsuolessa sitoutumaan antigeenia esittelevien solujen pinnalla oleviin tiettyihin HLA-DQ-reseptoreihin. DQ-reseptorit kuuluvat HLA-luokkaan II, jolloin niiden tehtävä on esitellä solun ulkoisia peptidejä imusoluille. T-solut sitoutuvat DQ-reseptorissa olevaan vieraaseen peptidiin, jolloin elimistön immuunipuolustus käynnistyy. Käynnistyneen immuunipuolustuksen seurauksena ohutsuolen nukkavilla tuhoutuu.
Tutkimukset ovat osoittaneet, että lähes jokaisella keliakiaa sairastavalla ihmisellä on jompikumpi keliakiaan yhdistetty reseptori, DQ2.5 tai DQ8. Reseptorit koostuvat α- sekä β-ketjusta, ja niitä koodaavat geenit sijaitsevat ihmisen kromosomissa 6. Geenejä kutsutaan HLA-DQA1:ksi ja HLA-DQB1:ksi sen mukaan, kumpaa ketjua ne koodaavat. Keliakiaa sairastavien ihmisten HLA-geeneissä on sellaisia alleeleja, jotka koodaavat juuri näitä kahta reseptoria.
Tämän insinöörityö tehtiin osana keliakian HLA-tyypitykseen liittyvää tuotekehitysprojektia. Projektin tavoitteena oli kehittää tuote, jolla pystyttäisiin luotettavasti detektoimaan genomisesta DNA:sta keliakian riskialleeleja qPCR-menetelmällä. Tämän insinöörityön tarkoituksena oli testata suunniteltuja alukkeita ja koettimia sekä optimoida reaktio-olosuhteita kahta multiplex-qPCR-reaktiota varten. Tavoitteena oli saada aikaan kaksi toimivaa multiplex-reaktiota.
Työ suoritettiin testaamalla eri aluke- ja koetinkonsentraatioita sekä niiden keskinäisiä suhteita. Työssä huomattiin, että koettimien suhde tulee olla suurempi alukkeisiin verrattuna. Silloin polymeraasientsyymi pystyy tuottamaan haluttua tuotetta spesifisemmin ja eri tuotteet erottuvat paremmin multiplex-reaktiossa. Insinöörityön tuloksena saatiin kaksi positiivisilla näytteillä toimivaa multiplex-reaktiota, jossa toisella pystytään detektoimaan A1-alleeleja ja toisella B1-alleeleja. Lisäksi työssä tutkittiin näiden reaktioiden spesifisyyttä. Alustavien tulosten perusteella kehitettävä menetelmä osoittautui epäspesifiseksi: alukkeet sitoutuivat oikean kohteen lisäksi samankaltaisiin alleeleihin, koska alleelien sekvenssit eroavat toisistaan usein pelkillä pistemutaatioilla. Valmiin ja kilpailukykyisen tuotteen saavuttamiseksi tulee reaktioita ja multiplex-olosuhteita optimoida lisää, esimerkiksi ajoparametreja muuttamalla.
Tutkimukset ovat osoittaneet, että lähes jokaisella keliakiaa sairastavalla ihmisellä on jompikumpi keliakiaan yhdistetty reseptori, DQ2.5 tai DQ8. Reseptorit koostuvat α- sekä β-ketjusta, ja niitä koodaavat geenit sijaitsevat ihmisen kromosomissa 6. Geenejä kutsutaan HLA-DQA1:ksi ja HLA-DQB1:ksi sen mukaan, kumpaa ketjua ne koodaavat. Keliakiaa sairastavien ihmisten HLA-geeneissä on sellaisia alleeleja, jotka koodaavat juuri näitä kahta reseptoria.
Tämän insinöörityö tehtiin osana keliakian HLA-tyypitykseen liittyvää tuotekehitysprojektia. Projektin tavoitteena oli kehittää tuote, jolla pystyttäisiin luotettavasti detektoimaan genomisesta DNA:sta keliakian riskialleeleja qPCR-menetelmällä. Tämän insinöörityön tarkoituksena oli testata suunniteltuja alukkeita ja koettimia sekä optimoida reaktio-olosuhteita kahta multiplex-qPCR-reaktiota varten. Tavoitteena oli saada aikaan kaksi toimivaa multiplex-reaktiota.
Työ suoritettiin testaamalla eri aluke- ja koetinkonsentraatioita sekä niiden keskinäisiä suhteita. Työssä huomattiin, että koettimien suhde tulee olla suurempi alukkeisiin verrattuna. Silloin polymeraasientsyymi pystyy tuottamaan haluttua tuotetta spesifisemmin ja eri tuotteet erottuvat paremmin multiplex-reaktiossa. Insinöörityön tuloksena saatiin kaksi positiivisilla näytteillä toimivaa multiplex-reaktiota, jossa toisella pystytään detektoimaan A1-alleeleja ja toisella B1-alleeleja. Lisäksi työssä tutkittiin näiden reaktioiden spesifisyyttä. Alustavien tulosten perusteella kehitettävä menetelmä osoittautui epäspesifiseksi: alukkeet sitoutuivat oikean kohteen lisäksi samankaltaisiin alleeleihin, koska alleelien sekvenssit eroavat toisistaan usein pelkillä pistemutaatioilla. Valmiin ja kilpailukykyisen tuotteen saavuttamiseksi tulee reaktioita ja multiplex-olosuhteita optimoida lisää, esimerkiksi ajoparametreja muuttamalla.