Master mix -reagenssiseoksen testaus qPCR:ää varten
Snellman, Lauri (2015)
Snellman, Lauri
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2015
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2015120920035
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2015120920035
Tiivistelmä
HLA-laboratoriossa tehdyn työn tarkoituksena oli löytää uusi master mix -reagenssiseos vanhan mixin tilalle qPCR-ajoihin. qPCR-menetelmää käytettiin potilasnäytteillä tehtäviin tutkimuksiin, joissa selvitettiin tiettyjä HLA-alueen geenejä (HLA eli Human Leucosyte An-tigen), jotka liittyvät erilaisiin tulehdus- ja autoimmuunisairauksiin kuten nivelreumaan ja sepelvaltimotautiin.
Master mix sisältää kaikki nukleotidit, puskuriliuoksen, entsyymin ja muita komponentteja, joita qPCR-reaktiot vaativat. Ainoastaan templaatti-DNA, sekä alukkeet puuttuvat. Testeihin valittiin 3 eri valmistajan kaupallista master mixiä (PerfeCTa, Brilliant III, FastStart). Potilasaineistosta valittiin joukko positiivisia ja negatiivisia näytteitä ajoja varten.
Testaukset aloitettiin testaamalla mixit ensin yhden tutkimuksen suhteen (HLA-C4B -geeni) optimiolojen löytämiseksi. Johtuen master mixien erilaisista ominaisuuksista, FastStart testattiin erikseen. Optimin löytämisen jälkeen testattiin loput geeniajot mixeillä eri reaktio-olosuhteissa. Näiden ensimmäisten testausten aikana FastStart pudotettiin pois, sillä Per-feCTa ja Brilliant III olivat nopeampia ja toimivat samoissa olosuhteissa. Testikierroksen jälkeen myös Brilliant III jätettiin pois ja lisätestaukset tehtiin pelkällä PerfeCTalla.
Toinen testikierros tehtiin ensimmäisen testikierroksen perusteella valituissa ajo-olosuhteissa. Ajoissa oli mukana sekä kontrolleja, että uusia potilasnäytteitä. Tulokset varmistettiin vielä vanhalla mixillä.
Lopuksi voitiin todeta, että Perfecta toimi jopa paremmin kuin vanha mix ja antoi samat tulokset (positiivinen kahdella tai yhdellä geenikopiolla tai negatiivinen). Se myös toimii nopeammin kuin vanha mix, minkä vuoksi qPCR-ajo on 30 minuuttia lyhyempi.
Master mix sisältää kaikki nukleotidit, puskuriliuoksen, entsyymin ja muita komponentteja, joita qPCR-reaktiot vaativat. Ainoastaan templaatti-DNA, sekä alukkeet puuttuvat. Testeihin valittiin 3 eri valmistajan kaupallista master mixiä (PerfeCTa, Brilliant III, FastStart). Potilasaineistosta valittiin joukko positiivisia ja negatiivisia näytteitä ajoja varten.
Testaukset aloitettiin testaamalla mixit ensin yhden tutkimuksen suhteen (HLA-C4B -geeni) optimiolojen löytämiseksi. Johtuen master mixien erilaisista ominaisuuksista, FastStart testattiin erikseen. Optimin löytämisen jälkeen testattiin loput geeniajot mixeillä eri reaktio-olosuhteissa. Näiden ensimmäisten testausten aikana FastStart pudotettiin pois, sillä Per-feCTa ja Brilliant III olivat nopeampia ja toimivat samoissa olosuhteissa. Testikierroksen jälkeen myös Brilliant III jätettiin pois ja lisätestaukset tehtiin pelkällä PerfeCTalla.
Toinen testikierros tehtiin ensimmäisen testikierroksen perusteella valituissa ajo-olosuhteissa. Ajoissa oli mukana sekä kontrolleja, että uusia potilasnäytteitä. Tulokset varmistettiin vielä vanhalla mixillä.
Lopuksi voitiin todeta, että Perfecta toimi jopa paremmin kuin vanha mix ja antoi samat tulokset (positiivinen kahdella tai yhdellä geenikopiolla tai negatiivinen). Se myös toimii nopeammin kuin vanha mix, minkä vuoksi qPCR-ajo on 30 minuuttia lyhyempi.