Pan-paramyksovirus RT-PCR:n pystytys ja käyttö linnuista peräisin olevissa näytteissä
Kuitunen, Essi (2015)
Kuitunen, Essi
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2015
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2015113018462
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2015113018462
Tiivistelmä
Opinnäytetyön tavoitteena oli tutkia ja testata tieteellisessä julkaisussa esitellyn lintujen paramyksovirusten serotyypit 1-9 sekä metapneumovirusalatyypit A, B ja C havaitsevan pan-paramyksovirus RT-PCR-menetelmän toimivuutta. Työ tehtiin Eviran eläintautivirologian tutkimusyksikössä, missä menetelmä haluttiin ottaa käyttöön.
Testaamisessa käytettiin positiivisia kontrollinäytteitä sekä 61 vesilintunäytteen otosta. Evirassa oli jo käytössä real-time RT-PCR -menetelmä APMV-1:n toteamiseksi. Myös tällä menetelmällä tutkittiin vesilintunäytteet. PCR-ajojen lisäksi työssä hyödynnettiin viruseristystä hedelmöitetyissä kananmunissa, hemagglutinaatiotestiä ja sekvensoimista.
Lähes kaikki positiiviset kontrollit onnistuttiin monistamaan pan-paramyksovirus RT-PCR-ajossa. Poikkeuksena olivat APMV-4- sekä NDV-positiivinen kontrollinäyte. Syynä oli mahdollisesti virus-stokin inaktivaatiomenetelmä, joka saattoi inhiboida PCR-reaktiota. APMV-4-positiivisen kontrollin sekvenssi erosi kolmen peräkkäisen nukleotidin verran toisen käytettävän alukkeen sekvenssistä, mikä saattoi myös vaikuttaa monistumisen epäonnistumiseen.
Pan-paramyksovirus RT-PCR -menetelmän etuna oli, että positiivisista näytteistä pystyttiin sekvensoimalla selvittämään, mitä paramyksovirusta ne sisälsivät. Sekvensoiminen osoittautui kuitenkin haastavaksi, koska monistettavan alueen pituus oli vain 70 nukelotidia. Lisäksi käytettävien alukkeiden nukleotideista noin kolmannes oli vaihtelevia emäksiä, mikä saattoi osaltaan vaikuttaa sekvensoimisen onnistumiseen. Sen vuoksi saatiin hyvin lyhyitä pätkiä sekvenssiä, jota voitiin verrata sekvenssitietokantaan.
Pan-paramyksovirus RT-PCR-menetelmä täydentää kuitenkin hyvin Eviran eläintautivirologian tutkimusosaston APMV-diagnostiikkaa. Se mahdollistaa APMV-1:n lisäksi muidenkin APMV-tyyppien toteamisen siipikarjan ja luonnonlintujen näytteistä. Menetelmällä positiivisiksi saadut näytteet vaativat jatkotutkimuksia todellisen APMV-tyypin selvittämiseksi. Tässä voidaan hyödyntää serotyyppispesifeillä alukkeilla tehtävää RT-PCR:ää ja sekvensointia.
Testaamisessa käytettiin positiivisia kontrollinäytteitä sekä 61 vesilintunäytteen otosta. Evirassa oli jo käytössä real-time RT-PCR -menetelmä APMV-1:n toteamiseksi. Myös tällä menetelmällä tutkittiin vesilintunäytteet. PCR-ajojen lisäksi työssä hyödynnettiin viruseristystä hedelmöitetyissä kananmunissa, hemagglutinaatiotestiä ja sekvensoimista.
Lähes kaikki positiiviset kontrollit onnistuttiin monistamaan pan-paramyksovirus RT-PCR-ajossa. Poikkeuksena olivat APMV-4- sekä NDV-positiivinen kontrollinäyte. Syynä oli mahdollisesti virus-stokin inaktivaatiomenetelmä, joka saattoi inhiboida PCR-reaktiota. APMV-4-positiivisen kontrollin sekvenssi erosi kolmen peräkkäisen nukleotidin verran toisen käytettävän alukkeen sekvenssistä, mikä saattoi myös vaikuttaa monistumisen epäonnistumiseen.
Pan-paramyksovirus RT-PCR -menetelmän etuna oli, että positiivisista näytteistä pystyttiin sekvensoimalla selvittämään, mitä paramyksovirusta ne sisälsivät. Sekvensoiminen osoittautui kuitenkin haastavaksi, koska monistettavan alueen pituus oli vain 70 nukelotidia. Lisäksi käytettävien alukkeiden nukleotideista noin kolmannes oli vaihtelevia emäksiä, mikä saattoi osaltaan vaikuttaa sekvensoimisen onnistumiseen. Sen vuoksi saatiin hyvin lyhyitä pätkiä sekvenssiä, jota voitiin verrata sekvenssitietokantaan.
Pan-paramyksovirus RT-PCR-menetelmä täydentää kuitenkin hyvin Eviran eläintautivirologian tutkimusosaston APMV-diagnostiikkaa. Se mahdollistaa APMV-1:n lisäksi muidenkin APMV-tyyppien toteamisen siipikarjan ja luonnonlintujen näytteistä. Menetelmällä positiivisiksi saadut näytteet vaativat jatkotutkimuksia todellisen APMV-tyypin selvittämiseksi. Tässä voidaan hyödyntää serotyyppispesifeillä alukkeilla tehtävää RT-PCR:ää ja sekvensointia.