Hiiren rustosoluviljelymallin pystyttäminen : Pharmatest Services Oy
Habilainen-Kirillov, Natalia (2014)
Habilainen-Kirillov, Natalia
Turun ammattikorkeakoulu
2014
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2014052810564
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2014052810564
Tiivistelmä
Mesenkymaaliset kantasolut ovat monikykyisiä soluja, joita löytyy useista aikuisen ihmisen kudoksista mm. luuytimestä, nivelkalvon kudoksista ja rasvakudoksesta. Mesenkyymisoluilla on kykyä uusiutua ja erilaistua useiksi solutyypeiksi. Ne voivat erilaistua rasvasoluiksi, luusoluiksi ja rustosoluiksi riippuen viljelyolosuhteista. Ruston erilaistuminen on monivaiheinen tapahtumasarja, jossa mesenkyymisolut tiivistyvät, erilaistuvat rustosoluiksi ja alkavat erittää soluväliaineen muodostavia proteiineja. Erilaistumista säädellään ajallisesti soluvuorovaikutusten ja kasvutekijöiden avulla, jotka muuttavat solun signalointireittejä ja tiettyjen geenien transkriptiota.
Tämän opinnäytetyön tavoitteena oli tutkia KS483 hiiren mesenkymaalisten kantasolujen soveltuvuutta ruston erilaistumisen in vitro-malliin ja optimoida soluviljelyolosuhteet. KS483 solut kykenevät erilaistumaan rustosoluiksi, rasvasoluiksi ja luuta muodostaviksi osteoblasteiksi. KS483-soluja viljeltiin seerumivapaassa kasvatusmediumissa, joka sisälsi erilaisten kasvutekijöiden lisäksi kolme pitoisuutta (100 ng/ml, 300 ng/ml ja 500 ng/ml) BPM-6 ja ilman BMP-6. Ruston erilaistumisen aikaansaamiseksi soluja viljeltiin 3-ulotteisena (3D) pellettiviljelmänä 96-kuoppalevyllä 17, 24 ja 28 päivän ajan. Kasvatusmediumi vaihdettiin 2 - 3 päivän välein. Erilaistumista rustosoluiksi arvioitiin biokemiallisilla analyyseilla, histologisin ja immunohistokemian menetelmin. Näillä analyyseilla pystytettiin havaitsemaan muutoksia solujen elinkyvyssä ja ruston soluväliaineen koostumuksessa mm. sGAG ja tyypin II kollageeni. Työssä saadut tulokset osoittavat, että KS483 hiiren solulinjaa voidaan käyttää rustosoluviljelymallin pystyttämiseen ja tämän mallin avulla voidaan jatkossa tutkia ruston erilaistumistapahtumaa ja seuloa uusia yhdisteitä, jotka vaikuttavat ruston erilaistumiseen.
Kolmiulotteisen pellettiviljelmän mahdollistamat solujen ja solu-soluväliaineen vuorovaikutukset sekä pelletin sisälle muodostuva hapen niukkuus ovat tärkeitä ruston tutkimisessa, koska tavanomaisissa 2D-soluviljelmissä nämä keskeiset edellytykset ovat huonosti toteutettavissa. Perinteisten in vitro ja in vivo mallien lisäksi uusien paremmin ennustavien 3D-soluviljelymallien kehitykselle on kysyntää ja tarvetta.
Opinnäytetyö tehtiin Pharmatest Services Oy:ssä (Pharmatest), joka on tutkimuspalveluja tarjoava yritys. Pharmatest on erikoistunut kliinisesti ennakoiviin prekliinisiin tehokkuustutkimuksiin onkologian ja luuston sairauksien terapia-alueilla. Yritys tarjoaa sekä tutkimuspalvelua varhaiseen lääkekehitykseen että mallien ja määritysten kehittämispalveluita.
Tämän opinnäytetyön tavoitteena oli tutkia KS483 hiiren mesenkymaalisten kantasolujen soveltuvuutta ruston erilaistumisen in vitro-malliin ja optimoida soluviljelyolosuhteet. KS483 solut kykenevät erilaistumaan rustosoluiksi, rasvasoluiksi ja luuta muodostaviksi osteoblasteiksi. KS483-soluja viljeltiin seerumivapaassa kasvatusmediumissa, joka sisälsi erilaisten kasvutekijöiden lisäksi kolme pitoisuutta (100 ng/ml, 300 ng/ml ja 500 ng/ml) BPM-6 ja ilman BMP-6. Ruston erilaistumisen aikaansaamiseksi soluja viljeltiin 3-ulotteisena (3D) pellettiviljelmänä 96-kuoppalevyllä 17, 24 ja 28 päivän ajan. Kasvatusmediumi vaihdettiin 2 - 3 päivän välein. Erilaistumista rustosoluiksi arvioitiin biokemiallisilla analyyseilla, histologisin ja immunohistokemian menetelmin. Näillä analyyseilla pystytettiin havaitsemaan muutoksia solujen elinkyvyssä ja ruston soluväliaineen koostumuksessa mm. sGAG ja tyypin II kollageeni. Työssä saadut tulokset osoittavat, että KS483 hiiren solulinjaa voidaan käyttää rustosoluviljelymallin pystyttämiseen ja tämän mallin avulla voidaan jatkossa tutkia ruston erilaistumistapahtumaa ja seuloa uusia yhdisteitä, jotka vaikuttavat ruston erilaistumiseen.
Kolmiulotteisen pellettiviljelmän mahdollistamat solujen ja solu-soluväliaineen vuorovaikutukset sekä pelletin sisälle muodostuva hapen niukkuus ovat tärkeitä ruston tutkimisessa, koska tavanomaisissa 2D-soluviljelmissä nämä keskeiset edellytykset ovat huonosti toteutettavissa. Perinteisten in vitro ja in vivo mallien lisäksi uusien paremmin ennustavien 3D-soluviljelymallien kehitykselle on kysyntää ja tarvetta.
Opinnäytetyö tehtiin Pharmatest Services Oy:ssä (Pharmatest), joka on tutkimuspalveluja tarjoava yritys. Pharmatest on erikoistunut kliinisesti ennakoiviin prekliinisiin tehokkuustutkimuksiin onkologian ja luuston sairauksien terapia-alueilla. Yritys tarjoaa sekä tutkimuspalvelua varhaiseen lääkekehitykseen että mallien ja määritysten kehittämispalveluita.