Transgeenisten kasvien geneettinen ja feno-tyyppinen analysointi
Roivas, Jenna (2014)
Roivas, Jenna
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2014
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201405219053
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201405219053
Tiivistelmä
Opinnäytetyö on osa Helsingin yliopiston Maatalous-metsätieteellisen tiedekunnan, Maataloustieteiden laitoksen projektia ”The characterization of Flower related Ubiquitin Proteasome System in Arapidopsis” (FUPS). Tutkimuksessa pyritään löytämään ne proteiinit, joita FUPS-kandidaatit hajottavat ja näin selvittää niiden tarpeellisuus kukan täydelliseen kehittymiseen.
Opinnäytetyön tavoitteena oli seuloa fenotyyppisesti sekä eri geneettisin analyysein projektissa tuotettuja siirtogeenisiä kasvilinjoja. Genotyyppausta tehtiin kasvilinjojen seulontavaiheessa, jonka tarkoituksena oli selvittää onko siirretyn geenin periytyminen tapahtunut oikein. Seulonta tehtiin toisen ja kolmannen sukupolven kasveille, joilla periytymisen oletettiin tapahtuvan Mendelin periytymissäännön mukaan. Arabidopsissiemenet kerättiin, steriloitiin ja istutettiin kasvatusmaljoille, josta suoritettiin seulonta muutaman viikon kasvatuksen jälkeen. Kolmannen sukupolven kasvit joiden oletettiin olevan homotsygootteja transgeenin suhteen, fenotyypitettiin. Proteiinien ilmentymistä selvitettiin coomassie värjäys ja immunoblottausmenetelmillä sekä geenin olemassaolo selvitettiin PCR:sta saadun monistetun geenituotteen ilmentymisellä geelielektroforeesissa. Coomassie-värjäys ja immunoblottaus menetelmissä havaittiin ainoastaan toinen integroitu geeni diploidihomotsygoottisista kasvilinjoista. Kyseisissä analyyseissä pystyttiin kuitenkin havaitsemaan tuntematon proteiiniraita kokojen 150 ja 250 kDa:n välissä. Ennen siirtogeenien havaitsemiseen tehtyä geelielektroforeesia suoritettiin PCR-testaus määrittämään optimaalinen monistuskierrosten määrä kullekin geenille. Testauksen yhteydessä huomattiin että geeni, joka ei ilmentynyt proteiinianalyyseissä, ei myöskään ilmentynyt elektroforeesissa. Toisen geenin ilmentyminen voidaan olettaa tapahtuneen, sillä PCR tuotteen pituus vastasi geenin pituutta.
Geeni, jota ei pystytty havaitsemaan tämän opinnäytetyön aikana tehdyissä analyyseissä, vaatii lisätutkimuksia sekä uusia sovelluksia ja olosuhteita, joissa mahdollisesti havaitaan geenituote sekä sen tuottama proteiini. Mukana olleet kontrollit toimivat moitteetta proteiinin ja geenin löytämiseksi käytetyissä menetelmissä. Tuntematon proteiiniraita jätti pohdittavaa tutkimusryhmälle sekä tarpeen luoda optimaaliset olosuhteet toisen integroidun geenin havaitsemiseksi.
Opinnäytetyön tavoitteena oli seuloa fenotyyppisesti sekä eri geneettisin analyysein projektissa tuotettuja siirtogeenisiä kasvilinjoja. Genotyyppausta tehtiin kasvilinjojen seulontavaiheessa, jonka tarkoituksena oli selvittää onko siirretyn geenin periytyminen tapahtunut oikein. Seulonta tehtiin toisen ja kolmannen sukupolven kasveille, joilla periytymisen oletettiin tapahtuvan Mendelin periytymissäännön mukaan. Arabidopsissiemenet kerättiin, steriloitiin ja istutettiin kasvatusmaljoille, josta suoritettiin seulonta muutaman viikon kasvatuksen jälkeen. Kolmannen sukupolven kasvit joiden oletettiin olevan homotsygootteja transgeenin suhteen, fenotyypitettiin. Proteiinien ilmentymistä selvitettiin coomassie värjäys ja immunoblottausmenetelmillä sekä geenin olemassaolo selvitettiin PCR:sta saadun monistetun geenituotteen ilmentymisellä geelielektroforeesissa. Coomassie-värjäys ja immunoblottaus menetelmissä havaittiin ainoastaan toinen integroitu geeni diploidihomotsygoottisista kasvilinjoista. Kyseisissä analyyseissä pystyttiin kuitenkin havaitsemaan tuntematon proteiiniraita kokojen 150 ja 250 kDa:n välissä. Ennen siirtogeenien havaitsemiseen tehtyä geelielektroforeesia suoritettiin PCR-testaus määrittämään optimaalinen monistuskierrosten määrä kullekin geenille. Testauksen yhteydessä huomattiin että geeni, joka ei ilmentynyt proteiinianalyyseissä, ei myöskään ilmentynyt elektroforeesissa. Toisen geenin ilmentyminen voidaan olettaa tapahtuneen, sillä PCR tuotteen pituus vastasi geenin pituutta.
Geeni, jota ei pystytty havaitsemaan tämän opinnäytetyön aikana tehdyissä analyyseissä, vaatii lisätutkimuksia sekä uusia sovelluksia ja olosuhteita, joissa mahdollisesti havaitaan geenituote sekä sen tuottama proteiini. Mukana olleet kontrollit toimivat moitteetta proteiinin ja geenin löytämiseksi käytetyissä menetelmissä. Tuntematon proteiiniraita jätti pohdittavaa tutkimusryhmälle sekä tarpeen luoda optimaaliset olosuhteet toisen integroidun geenin havaitsemiseksi.