Immunohistokemiallisten värjäysmenelmien pystytys hiiren kudosleikkeille
Hirvonen, Maria Karoliina (2013)
Hirvonen, Maria Karoliina
Turun ammattikorkeakoulu
2013
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2013060312483
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2013060312483
Tiivistelmä
Immunohistokemialliset värjäysmenetelmät ovat kehittyneet huomattavasti viime vuosien aikana
ja tulleet tärkeiksi tutkimustyökaluiksi erityisesti biologiaan liittyvillä aloilla. Useat asiat
vaikuttavat värjäysten laatuun tehden siitä ajoittain haastavaa.
Opinnäytetyön tarkoituksena oli pystyttää kaksi erillistä immunohistokemiallista
värjäysmenetelmää liittyen kahteen eri tutkimukseen ja keskittyä erityisesti värjäysten tuomiin
haasteisiin. Ensimmäisessä tutkimuksessa pyrittiin havaitsemaan α2A-adrenoseptorisiirtogeenin
ilmeneminen hiiren kudoksessa hemagglutiniiniepitoopin (HA) avulla. Immunohistokemialliset
värjäykset suoritettiin, koska haluttiin varmuus siitä, että siirtogeeni ilmenee hiiressä myös
proteiinitasolla. Sekä fluoresenssivärjäystä että epäsuoraa avidiini-biotiinikompleksimenetelmää
(ABC) kokeiltiin värjäyksen pystytyksessä. Värjäysprotokolla pyrittiin
optimoimaan lisämunuaisleikkeillä, mutta kuorikerroksella ilmenevän autofluoresenssin johdosta
fluoresenssivärjäyksestä luovuttiin. Primaarivasta-aineena käytettiin polyklonaalista kanissa
tuotettuja HA-vasta-ainetta. Tulokset pysyivät negatiivisina huolimatta useista vasta-aineiden
pitoisuuksien ja inkubaatioaikojen muutoksista sekä esikäsittelystä liittyen antigeenien
paljastukseen. Myös värjäykset toisen eri valmistajan HA-vasta-aineen kanssa tuottivat
samankaltaisia tuloksia. Lopulta molempien HA-vasta-aineiden soveltuvuus värjäyksiin testattiin
toimivaksi todetulla immunosytokemiallisella fluoresenssivärjäyksellä. Positiivisena kontrollina
käytettiin monoklonaalista hiiressä tuotettua vasta-ainetta. Samaa protokollaa noudattaen
suoritettiin värjäykset molemmilla HA-vasta-aineilla useita laimennuksia käyttäen. Kummankaan
vasta-aineen kohdalla ei selvästi havaittavaa värjäytymää syntynyt. Tulosten perusteella vastaaineet
eivät todennäköisesti soveltuneet kyseisiin värjäyksiin. Toinen tutkimus liittyi
melanokortiini-4 reseptorin havainnointiin hiiren sydänkudoksessa. Primaarivasta-aineena
käytettiin kanissa tuotettua polyklonaalista vasta-ainetta. ABC-menetelmällä tehtiin useita
värjäyksiä muuttaen vasta-aineiden laimennussuhteita ja inkubaatioaikoja. Myös antigeenien
paljastusta kokeiltiin. Kaikki tulokset olivat kuitenkin negatiivisia.
ja tulleet tärkeiksi tutkimustyökaluiksi erityisesti biologiaan liittyvillä aloilla. Useat asiat
vaikuttavat värjäysten laatuun tehden siitä ajoittain haastavaa.
Opinnäytetyön tarkoituksena oli pystyttää kaksi erillistä immunohistokemiallista
värjäysmenetelmää liittyen kahteen eri tutkimukseen ja keskittyä erityisesti värjäysten tuomiin
haasteisiin. Ensimmäisessä tutkimuksessa pyrittiin havaitsemaan α2A-adrenoseptorisiirtogeenin
ilmeneminen hiiren kudoksessa hemagglutiniiniepitoopin (HA) avulla. Immunohistokemialliset
värjäykset suoritettiin, koska haluttiin varmuus siitä, että siirtogeeni ilmenee hiiressä myös
proteiinitasolla. Sekä fluoresenssivärjäystä että epäsuoraa avidiini-biotiinikompleksimenetelmää
(ABC) kokeiltiin värjäyksen pystytyksessä. Värjäysprotokolla pyrittiin
optimoimaan lisämunuaisleikkeillä, mutta kuorikerroksella ilmenevän autofluoresenssin johdosta
fluoresenssivärjäyksestä luovuttiin. Primaarivasta-aineena käytettiin polyklonaalista kanissa
tuotettuja HA-vasta-ainetta. Tulokset pysyivät negatiivisina huolimatta useista vasta-aineiden
pitoisuuksien ja inkubaatioaikojen muutoksista sekä esikäsittelystä liittyen antigeenien
paljastukseen. Myös värjäykset toisen eri valmistajan HA-vasta-aineen kanssa tuottivat
samankaltaisia tuloksia. Lopulta molempien HA-vasta-aineiden soveltuvuus värjäyksiin testattiin
toimivaksi todetulla immunosytokemiallisella fluoresenssivärjäyksellä. Positiivisena kontrollina
käytettiin monoklonaalista hiiressä tuotettua vasta-ainetta. Samaa protokollaa noudattaen
suoritettiin värjäykset molemmilla HA-vasta-aineilla useita laimennuksia käyttäen. Kummankaan
vasta-aineen kohdalla ei selvästi havaittavaa värjäytymää syntynyt. Tulosten perusteella vastaaineet
eivät todennäköisesti soveltuneet kyseisiin värjäyksiin. Toinen tutkimus liittyi
melanokortiini-4 reseptorin havainnointiin hiiren sydänkudoksessa. Primaarivasta-aineena
käytettiin kanissa tuotettua polyklonaalista vasta-ainetta. ABC-menetelmällä tehtiin useita
värjäyksiä muuttaen vasta-aineiden laimennussuhteita ja inkubaatioaikoja. Myös antigeenien
paljastusta kokeiltiin. Kaikki tulokset olivat kuitenkin negatiivisia.