Hiivavektoreiden muokkaus Golden Gate Shuffling -menetelmää varten
Sulkakoski, Anna (2012)
Sulkakoski, Anna
Turun ammattikorkeakoulu
2012
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2012092713919
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2012092713919
Tiivistelmä
Golden Gate Shuffling on tyypin IIs restriktioentsyymeihin perustuva kloonausmenetelmä. Sen tarkoituksena on nopeuttaa moniosaisten inserttien yhdistämistä ja kloonausta geenivektoriin.
Tässä työssä oli tarkoitus muokata kahta Pichia pastoriksessa käytettävää plasmidivektoria (pPICZ A ja pGAPZ A; Invitrogen) siten, että niihin voidaan siirtää inserttejä Golden Gate Shuffling -kloonausmenetelmällä.
Vektoreista poistettiin ensin kolme BsaI-tunnistuskohtaa. Tämä tapahtui PCR:n ja mutatoitujen koettimien avulla. Tämän jälkeen suunniteltiin ja tehtiin kaksi uutta BsaI-tunnistuskohtaa plasmidien monikloonausalueille. Golden Gate Shuffling -kloonausmenetelmän toimivuus testattiin ja tehtiin tuottotesti Pichia pastoriksessa.
Suunnitellut muokkaukset suoritettiin kummallekin vektorille. Shuffling-menetelmän käyttö vaatinee kuitenkin optimointia riippuen käytettävien insertien määrästä.
Vastaavanlaisten vektorimuokkausten kannattavuutta tulee harkita tulevaisuudessa DNA-syntetiikan kehittyessä ja tullessa yhä edullisemmaksi. Tällä hetkellä in vitro DNA-synteesillä kyetään jo helposti tuottamaan yli 3 kb:n kappaleita ja tilattuna tämän kokoisen palan hinnaksi tulisi hieman yli 1000 euroa. Hinta on erittäin alhainen tehtyyn työmäärään ja reagenssimäärään nähden.
Tässä työssä oli tarkoitus muokata kahta Pichia pastoriksessa käytettävää plasmidivektoria (pPICZ A ja pGAPZ A; Invitrogen) siten, että niihin voidaan siirtää inserttejä Golden Gate Shuffling -kloonausmenetelmällä.
Vektoreista poistettiin ensin kolme BsaI-tunnistuskohtaa. Tämä tapahtui PCR:n ja mutatoitujen koettimien avulla. Tämän jälkeen suunniteltiin ja tehtiin kaksi uutta BsaI-tunnistuskohtaa plasmidien monikloonausalueille. Golden Gate Shuffling -kloonausmenetelmän toimivuus testattiin ja tehtiin tuottotesti Pichia pastoriksessa.
Suunnitellut muokkaukset suoritettiin kummallekin vektorille. Shuffling-menetelmän käyttö vaatinee kuitenkin optimointia riippuen käytettävien insertien määrästä.
Vastaavanlaisten vektorimuokkausten kannattavuutta tulee harkita tulevaisuudessa DNA-syntetiikan kehittyessä ja tullessa yhä edullisemmaksi. Tällä hetkellä in vitro DNA-synteesillä kyetään jo helposti tuottamaan yli 3 kb:n kappaleita ja tilattuna tämän kokoisen palan hinnaksi tulisi hieman yli 1000 euroa. Hinta on erittäin alhainen tehtyyn työmäärään ja reagenssimäärään nähden.