Eph-reseptorin kloonaus, tuotto ja puhdistus hyönteissoluista
Mamandi, Shevin (2012)
Mamandi, Shevin
Turun ammattikorkeakoulu
2012
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2012061412678
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2012061412678
Tiivistelmä
Tämä opinnäytetyö tehtiin Joint Biotechnology Laboratoryssa osana Eph-reseptoreiden ja efriiniligandien sitoutusmis- ja rakennetutkimusta.
Opinnäytetyössä EphA2-reseptoriproteiinin koko geeni kloonattiin pMA152-a hyönteissoluvektoriin ja transformoitiin E.coli-soluhin. Opinnäytetyössä tuotettiin yhdistelmä-DNA-plasmidi yhdistelmä-DNA-tekniikoilla.
Työssä käytettyjä hyönteissoluja olivat Sf9 ja Hi5. Sf9 soluja käytettiin viruksen tuotossa ja Hi5 soluja käytettiin efriiniA5-ligandiproteiinin sekä EphA2-reseptoriproteiinin tuotossa.
Tuotettu efriini A5-ligandi puhdistettiin proteiini A-pylväällä ja EphA2-reseptori puhdistettiin Ni-pylväällä. Alkuvaiheessa EphA2 geeniin c-terminaaliin oltiin kiinnitetty histidiinihäntä, joka mahdollisiti proteiinin puhdistuksen nikkeligeelipylväällä.
Analysointiin käytettiin yhdistelmä-DNA-menetelmien aikana agaroosigeelielektroforeesia. Proteiinin tuotto vaiheessa näytteet analysointiin SDS-PAGE ja Western blotting menetelmillä.
Aikaisemmissa opinnäytetöissä oli tuotettu ainostaan osaa Eph-reseptorista, mutta tässä opinnäytetyössä tuotettiin Eph-reseptorin koko geenin proteiinia ja analyysien perusteella proteiinin tuottaminen onnistui.
Opinnäytetyössä EphA2-reseptoriproteiinin koko geeni kloonattiin pMA152-a hyönteissoluvektoriin ja transformoitiin E.coli-soluhin. Opinnäytetyössä tuotettiin yhdistelmä-DNA-plasmidi yhdistelmä-DNA-tekniikoilla.
Työssä käytettyjä hyönteissoluja olivat Sf9 ja Hi5. Sf9 soluja käytettiin viruksen tuotossa ja Hi5 soluja käytettiin efriiniA5-ligandiproteiinin sekä EphA2-reseptoriproteiinin tuotossa.
Tuotettu efriini A5-ligandi puhdistettiin proteiini A-pylväällä ja EphA2-reseptori puhdistettiin Ni-pylväällä. Alkuvaiheessa EphA2 geeniin c-terminaaliin oltiin kiinnitetty histidiinihäntä, joka mahdollisiti proteiinin puhdistuksen nikkeligeelipylväällä.
Analysointiin käytettiin yhdistelmä-DNA-menetelmien aikana agaroosigeelielektroforeesia. Proteiinin tuotto vaiheessa näytteet analysointiin SDS-PAGE ja Western blotting menetelmillä.
Aikaisemmissa opinnäytetöissä oli tuotettu ainostaan osaa Eph-reseptorista, mutta tässä opinnäytetyössä tuotettiin Eph-reseptorin koko geenin proteiinia ja analyysien perusteella proteiinin tuottaminen onnistui.