Uusien steroideja sitovien avidiinimutanttien tuotto ja karakterisointi
Kähkönen, Niklas (2011)
Kähkönen, Niklas
Tampereen ammattikorkeakoulu
2011
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2011121418375
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2011121418375
Tiivistelmä
Homotetrameerinen avidiini-proteiini tunnetaan sen huomattavan korkeasta affiniteetista ligandiinsa biotiiniin. Korkean affiniteetin lisäksi avidiini on proteiinina poikkeuksellisen kestävä ulkoisia voimia vastaan. Ensiluokkainen kestävyys ja korkea affiniteetti ligandia kohtaan tekevät avidiinista mielenkiintoisen tutkimuskohteen eri sovelluksiin. Avidiinin ligandinsitomista on tutkittu runsaasti ja proteiinia on muokattu niin kemiallisesti kuin geneettisestikin. Muokkaamalla avidiinin ligandinsitomispaikkaa on saatu aikaan steroideja sitovia avidiinimutantteja, joiden affiniteetti biotiinille on vähentynyt.
Opinnäytetyön tarkoituksena oli tutkia kahdelle uudelle steroideja sitoville avidiinimutanteille tehtyjen pistemutaatioiden vaikutusta proteiinin tuottoon, lämpöstabiiliuteen ja ligandin sitomisaffiniteettiin. Pistemutaatiot olivat muutos isoleusiinista tyrosiiniksi kohdassa 117 (I117Y) tai asparagiinista asparagiinihapoksi kohdassa 118 (N118D). Proteiinit tuotettiin pullokasvatuksina Escherichia coli -solujen periplasmiseen tilaan ja puhdistettiin affiniteettikromatografisesti nikkeli-sefaroosi-matriisilla ja puhtautta arvioitiin geelielektroforeesilla. Proteiinien aktiivisuutta ja stabiilisuutta karakterisoitiin geelisuodatuksen avulla ja kalorimetrisin kokein niin differentiaalisella pyyhkäisykalorimetrialla kuin isotermisellä titrauskalorimetriallakin.
Pistemutatoituja avidiinimutantteja saatiin tuotettua liukoisena ja aktiivisessa tetrameerisessä muodossaan. Proteiinit ekspressoituivat erittäin hyvin. N118- pistemutantin havaittiin suosivan testosteronin sitoutumista verrattuna progesteroniin, mutta sen lämpöstabiliteetti oli alentunut. I117Y-pistemutantin tuotto oli selkeästi N118D-pistemutanttia parempaa. I117Y-pistemutaation vaikutus proteiinin lämpöstabiiliuteen oli huomattava. Ligandinsitomisaffiniteetteja ei onnistuttu luotettavasti määrittämään titrauskalorimetrialla, mutta affiniteetti biotiinia kohtaan näytti selvästi heikenneen kaikilla proteiinimutanteilla.
Uusista pistemutaatioista avidiinin steroideja sitoviin mutantteihin saatiin paljon hyödyllistä tietoa proteiinien toiminnan kannalta. Tulevaisuudessa voitaisiin selvittää molempien pistemutaatioiden toiminta yhdessä. Lisäksi affiniteetti eri ligandeja kohtaan tulisi määrittää joko eri olosuhteissa tai eri menetelmällä.
Opinnäytetyön tarkoituksena oli tutkia kahdelle uudelle steroideja sitoville avidiinimutanteille tehtyjen pistemutaatioiden vaikutusta proteiinin tuottoon, lämpöstabiiliuteen ja ligandin sitomisaffiniteettiin. Pistemutaatiot olivat muutos isoleusiinista tyrosiiniksi kohdassa 117 (I117Y) tai asparagiinista asparagiinihapoksi kohdassa 118 (N118D). Proteiinit tuotettiin pullokasvatuksina Escherichia coli -solujen periplasmiseen tilaan ja puhdistettiin affiniteettikromatografisesti nikkeli-sefaroosi-matriisilla ja puhtautta arvioitiin geelielektroforeesilla. Proteiinien aktiivisuutta ja stabiilisuutta karakterisoitiin geelisuodatuksen avulla ja kalorimetrisin kokein niin differentiaalisella pyyhkäisykalorimetrialla kuin isotermisellä titrauskalorimetriallakin.
Pistemutatoituja avidiinimutantteja saatiin tuotettua liukoisena ja aktiivisessa tetrameerisessä muodossaan. Proteiinit ekspressoituivat erittäin hyvin. N118- pistemutantin havaittiin suosivan testosteronin sitoutumista verrattuna progesteroniin, mutta sen lämpöstabiliteetti oli alentunut. I117Y-pistemutantin tuotto oli selkeästi N118D-pistemutanttia parempaa. I117Y-pistemutaation vaikutus proteiinin lämpöstabiiliuteen oli huomattava. Ligandinsitomisaffiniteetteja ei onnistuttu luotettavasti määrittämään titrauskalorimetrialla, mutta affiniteetti biotiinia kohtaan näytti selvästi heikenneen kaikilla proteiinimutanteilla.
Uusista pistemutaatioista avidiinin steroideja sitoviin mutantteihin saatiin paljon hyödyllistä tietoa proteiinien toiminnan kannalta. Tulevaisuudessa voitaisiin selvittää molempien pistemutaatioiden toiminta yhdessä. Lisäksi affiniteetti eri ligandeja kohtaan tulisi määrittää joko eri olosuhteissa tai eri menetelmällä.