In vitro -määrityksen kehittäminen β-amyloidien aggregaation havaitsemiseen
Jacobino, Jenna (2011)
Jacobino, Jenna
Turun ammattikorkeakoulu
2011
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201105096791
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201105096791
Tiivistelmä
Opinnäytetyön tarkoituksena oli kehittää uusi menetelmä β-amyloidien aggregaation havaitsemiseen. Opinnäytetyö suoritettiin Turun yliopiston biolääketieteen laitoksella osana projektia, jossa kehitettiin nanopartikkeliperusteista, epäspesifistä menetelmää Alzheimerin taudin tutkimukseen.
Menetelmä perustui aikaerotteisen fluoresenssin resonanssienergian siirron havaitsemiseen. Määrityksessä akseptorina toimivat Alexa Fluor 680 -värillä leimatut gammaglobuliinit kilpailivat β-amyloidien tai β-amyloidiaggregaattien kanssa adsorboitumisesta donorina toimivien Eu(III)-nanopartikkelien pinnalle. Energiansiirtosignaalin suuruus muuttui suhteessa adsorboituneen leimaproteiinin määrään.
Työssä pyrittiin optimoimaan mittausolosuhteita sekä tutkimaan, miten eri olosuhteet vaikuttivat β-amyloidien aggregoitumiseen ja miten se näkyi mitattavassa signaalissa. Lisäksi testattiin inkubointiajan vaikutusta β-amyloidien aggregoitumiseen. Käytettyjä laimennusliuoksia olivat dimetyylisulfoksidi, Ham´s F-12 -medium, fosfaattipuskuroitu suolaliuos, 10 mM suolahappo, suolaliuos (10 mM HCl, 150 mM NaCl) ja vesi. Työssä tutkittiin myös kurkumiini-lääkeaineen vaikutusta aggregaattien muodostumisessa. Lopuksi menetelmän toimivuutta tutkittiin absorbanssimittausten ja Western blot -analyysin avulla.
Menetelmän dynaamiseksi mittausalueeksi arvioitiin 25-700 µg/l aggregoitumattomalle β-amyloidipeptidille. Mitattaessa vedessä ja dimetyylisulfoksidissa inkuboituja β-amyloidinäytteitä inkubaatioajan funktiona, energiansiirtosignaali ei kasvanut tai kasvoi hitaasti, mikä tarkoittaisi β-amyloidien säilymistä monomeereina ainakin lyhyitä aikoja. Muissa olosuhteissa β-amyloidit aggregoituivat voimakkaammin. Partikkeliperusteisen menetelmän tulosten mukaan kurkumiinilla ei voitu osoittaa olevan vaikutusta β-amyloidiaggregaattien muodostumiseen.
Menetelmä perustui aikaerotteisen fluoresenssin resonanssienergian siirron havaitsemiseen. Määrityksessä akseptorina toimivat Alexa Fluor 680 -värillä leimatut gammaglobuliinit kilpailivat β-amyloidien tai β-amyloidiaggregaattien kanssa adsorboitumisesta donorina toimivien Eu(III)-nanopartikkelien pinnalle. Energiansiirtosignaalin suuruus muuttui suhteessa adsorboituneen leimaproteiinin määrään.
Työssä pyrittiin optimoimaan mittausolosuhteita sekä tutkimaan, miten eri olosuhteet vaikuttivat β-amyloidien aggregoitumiseen ja miten se näkyi mitattavassa signaalissa. Lisäksi testattiin inkubointiajan vaikutusta β-amyloidien aggregoitumiseen. Käytettyjä laimennusliuoksia olivat dimetyylisulfoksidi, Ham´s F-12 -medium, fosfaattipuskuroitu suolaliuos, 10 mM suolahappo, suolaliuos (10 mM HCl, 150 mM NaCl) ja vesi. Työssä tutkittiin myös kurkumiini-lääkeaineen vaikutusta aggregaattien muodostumisessa. Lopuksi menetelmän toimivuutta tutkittiin absorbanssimittausten ja Western blot -analyysin avulla.
Menetelmän dynaamiseksi mittausalueeksi arvioitiin 25-700 µg/l aggregoitumattomalle β-amyloidipeptidille. Mitattaessa vedessä ja dimetyylisulfoksidissa inkuboituja β-amyloidinäytteitä inkubaatioajan funktiona, energiansiirtosignaali ei kasvanut tai kasvoi hitaasti, mikä tarkoittaisi β-amyloidien säilymistä monomeereina ainakin lyhyitä aikoja. Muissa olosuhteissa β-amyloidit aggregoituivat voimakkaammin. Partikkeliperusteisen menetelmän tulosten mukaan kurkumiinilla ei voitu osoittaa olevan vaikutusta β-amyloidiaggregaattien muodostumiseen.