Coronavirusten esiintyminen epidemiologisessa tutkimusaineistossa : Humaanien coronavirusten esiintyvyyden tutkiminen PCR-menetelmällä Tampereen yliopiston lääketieteen laitoksen virologian yksikössä
Tiainen, Anna (2009)
Tiainen, Anna
Pirkanmaan ammattikorkeakoulu
2009
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-200905203021
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-200905203021
Tiivistelmä
Tampereen yliopiston lääketieteen laitokselle, virologian yksikköön on kerätty vuosina 2006-2008 Tampereen ja Kuopion yliopistollisista sairaaloista ulostenäytteitä epidemiologista tutkimusta varten. Näytteitä on kerätty sairaalahoitoon ripulin tai oksentelun takia tuoduilta lapsilta. Verrokkiryhminä olivat epäselvää kuumeilua tai hengitystieinfektiota potevat sekä kliinisesti terveet lapset. Näistä näytteistä on tutkittu polymeraasiketjureaktiolla rota-, noro-, aichi- ja bocavirukset, ja tutkimusta haluttiin laajentaa koskemaan myös coronavirusten esiintyvyyttä. Osuuteni tutkimuksessa käsitti vuonna 2007 Kuopiosta ja Tampereelta kerättyjen, akuuttiin gastroenteriittiin sairatuneiden lasten näytteiden tutkiminen. Aiheen sain tutkijalääkäri Minna Riskulta syksyllä 2008.
Tutkittava aineisto koostui 380:sta näytteestä, joista oli valmiiksi eristetty RNA. Eristetylle RNA:lle oli tehty RT- eli käänteiskopiointireaktio ennen varsinaista PCR- eli polymeraasiketjureaktiota. RT-reaktiossa RNA käännetään cDNA:ksi jota PCR-menetelmällä voidaan monistaa. Reaktio oli universaali, jolloin samasta RT-tuotteesta voitiin eri PCR-menetelmin monistaa kaikkia cDNA-juosteita. Käytettävä PCR-reaktio oli spesifi coronaviruksille, ja siinä oli kaksi vaihetta. Ensimmäisessä monistettiin kaikkia mahdollisia coronavirustyyppejä polymeraasialueen nukleotidijärjestyksen perusteella, ja toisessa vaiheessa eriteltiin löydetyt coronavirustyypit kolmeen ryhmään. Tämän jälkeen PCR-tuotteet analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla. Positiiviset näytteet laitettiin talteen odottamaan sekvensointia jolla tulos varmistetaan ja varsinainen virustyyppi selvitetään lopullisesti.
Tulokset olivat luotettavia, sillä kussakin sarjassa käytettiin negatiivista ja positiivista kontrollia. Näistä saatiin aina haluttu tulos, mikä kertoo työtapojen olleen oikeat sekä alukkeiden ja reagenssien toimivan oikein. Työn tuloksena voitiin todeta eri coronavirusten esiintyvän näytteissä, mutta taudin aiheuttamiskyvystä ei olla varmoja. Useimmista näytteistä löytyi kaksoisinfektioita, ja verrokkiryhmien tutkiminen on kesken.
Tutkittava aineisto koostui 380:sta näytteestä, joista oli valmiiksi eristetty RNA. Eristetylle RNA:lle oli tehty RT- eli käänteiskopiointireaktio ennen varsinaista PCR- eli polymeraasiketjureaktiota. RT-reaktiossa RNA käännetään cDNA:ksi jota PCR-menetelmällä voidaan monistaa. Reaktio oli universaali, jolloin samasta RT-tuotteesta voitiin eri PCR-menetelmin monistaa kaikkia cDNA-juosteita. Käytettävä PCR-reaktio oli spesifi coronaviruksille, ja siinä oli kaksi vaihetta. Ensimmäisessä monistettiin kaikkia mahdollisia coronavirustyyppejä polymeraasialueen nukleotidijärjestyksen perusteella, ja toisessa vaiheessa eriteltiin löydetyt coronavirustyypit kolmeen ryhmään. Tämän jälkeen PCR-tuotteet analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla. Positiiviset näytteet laitettiin talteen odottamaan sekvensointia jolla tulos varmistetaan ja varsinainen virustyyppi selvitetään lopullisesti.
Tulokset olivat luotettavia, sillä kussakin sarjassa käytettiin negatiivista ja positiivista kontrollia. Näistä saatiin aina haluttu tulos, mikä kertoo työtapojen olleen oikeat sekä alukkeiden ja reagenssien toimivan oikein. Työn tuloksena voitiin todeta eri coronavirusten esiintyvän näytteissä, mutta taudin aiheuttamiskyvystä ei olla varmoja. Useimmista näytteistä löytyi kaksoisinfektioita, ja verrokkiryhmien tutkiminen on kesken.