Effect of oligosaccharyltransferase on glycosylation efficiency

No Thumbnail Available
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Kemian tekniikan korkeakoulu | Master's thesis
Date
2023-01-24
Department
Major/Subject
Biotechnology
Mcode
CHEM3022
Degree programme
Master's Programme in Chemical, Biochemical and Materials Engineering
Language
en
Pages
41+7
Series
Abstract
Protein-linked N-glycosylation is an important post-translational modification in eukaryotes, which is important for protein solubility, stability, and functions. N-glycosylation consists of two steps: the construction of a lipid-linked oligosaccharide and the transfer of the oligosaccharide by the oligosacchrayltransferase complex. N-glycosylation is also important in the production of therapeutic antibodies, as the N-glycan structure affects the efficiency of the antibodies. It is also possible for a protein to not receive an N-glycan at all in a process called hypoglycosylation. Previ-ous research has shown that proteins in a yeast strain with a modified LLO biosynthesis are hypo-glycosylated. This master’s thesis aimed to improve glycosylation efficiency of a model antibody. A yeast strain with genetic modifications done on the LLO biosynthesis and producing a truncated N-glycan was used. A set of eight different oligosaccharyltransferases was transformed into the strain to test their effect on glycosylation efficiency. Glycosylation efficiency was studied with a Western blot analysis, with replicate blots prepared for the detection of IgG heavy chain and PDI1. Growth phe-notypes were tested with a spotting assay, because growth is linked to glycosylation with hypogly-cosylation inhibiting growth and increased glycosylation efficiency increasing growth. ELISA was used to determine the secreted antibody concentrations. No differences in glycosylation efficiency between the strains could be observed. This was backed up by the fact that there were only little differences in the growth of the strains. However, unlike in previous studies, the IgG proteins were mostly glycosylated rather than hypoglycosylated as has been previously observed.

Proteiinien N-glykosylaatio on tärkeä posttranslationaalinen muokkaus eukaryooteissa, ja se on tärkeää proteiinien liukoisuuden, stabiiliuden ja toiminnan kannalta. N-glykosylaatio koostuu kahdesta vaiheesta: LLO-molekyylin (Lipid-linked oligosaccharide) muodostaminen ja oligosakkaridin siirto, jota katalysoi oligosakkaryylitransferaasikompleksi. N-glykosylaatio on tärkeää myös terapeuttisten vasta-aineiden tuotannon kannalta, sillä N-glykaanin rakenne vaikuttaa vasta-aineiden tehokkuuteen. On myös mahdollista, että proteiini ei saa yhtään N-glykaania, mitä kutsutaan hypoglykosylaatioksi. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että hiivakanta, jonka LLO biosynteesiin on tehty muutoksia, tuottaa aliglykosyloituja proteiineja. Tämä diplomityö pyrki parantamaan mallivasta-aineen glykolysaatiotehokkuutta. Tähän käytettiin hiivakantaa, jonka LLO biosynteesiin oli tehty muutoksia, ja joka tuotti lyhennettyä N-glykaania. Kahdeksan erilaista oligosakkaryylitransferaasia transformoitiin tähän kantaan, jotta niiden vaikutus glykosylaation tehokkuuteen saataisiin tutkittua. Glykosylaatiotehokkuus määritettiin Western blot -analyysin avulla, ja bloteista valmistettiin kopiot IgG raskasketjun ja PDI1:n havaitsemiseen. Kasvufenotyypit selvitettiin spotting assay -kokeella, koska kasvu ja glykosylaatio liittyvät toisiinsa: hypoglykosylaatio rajoittaa kasvua, ja glykosylaation tehokkuuden paraneminen lisää kasvua. ELISA-analyysiä käytettiin solujen erittäminen vasta-ainekonsentraatioiden määrittämiseen. Glykosylaatiotehokkuudessa ei havaittu eroja eri hiivakantojen välillä. Tätä tuki myös havainto siitä, että kantojen kasvussa oli vain vähän eroja. Kuitenkin aiemmista tutkimuksista poiketen IgG proteiinit olivat suurimmaksi osaksi glykosyloituja toisin kuin aliglykosyloituja, kuten oli aikasemmin havaittu.
Description
Supervisor
Frey, Alexander
Thesis advisor
Nguyen, An
Niemelä, Laura
Keywords
N-glycosylation, glycosylation efficiency, yeast, oligosaccharyltransferase
Other note
Citation