RNA-polymeraasin peruuttamisen mekanismi transkription pysähtymisessä
Mäkinen, Janne (2018-08-14)
RNA-polymeraasin peruuttamisen mekanismi transkription pysähtymisessä
Mäkinen, Janne
(14.08.2018)
Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.
avoin
Julkaisun pysyvä osoite on:
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2018090334502
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2018090334502
Tiivistelmä
Geenien ilmenemisen ensimmäisessä vaiheessa, transkriptiossa, RNA-polymeraasi
syntetisoi RNA:ta DNA:n emäsjärjestyksen mukaisesti.
Transkription aikana RNA-polymeraasi satunnaisesti peruuttaa eli liikkuu
taaksepäin DNA-juostetta pitkin työntäen RNA:n 3’-pään pois aktiivisesta
keskuksesta. Peruutustilassa RNA:n pidentyminen estyy ja transkriptio
pysähtyy. Poistuakseen peruutustilasta RNA-polymeraasin on (i) liikuttava
eteenpäin tai (ii) leikattava nukleotidejä RNA:n 3’-päästä, jotta aktiivinen keskus
vapautuu. RNA-polymeraasin peruuttaminen on tärkeä osa geenien
ilmenemisen säätelyä ja RNA-polymeraasin tekemien virheiden korjaamista
kaikilla eliöillä. Peruutustilan muodostumisen ja RNA:n leikkautumisen
mekanismia ei kuitenkaan vielä täysin tunneta.
Tutkimuksessani selvitin peruutustilasta palautumisen ja RNA:n leikkautumisen
mekanismia lyhyissä peruutustiloissa. Tätä varten kehitimme koeasetelmia,
jotka mahdollistavat peruutustilan määrän ja stabiilisuuden tarkastelun.
Hyödynsin entsyymikineettisiä menetelmiä ja RNA-polymeraasin aktiiviseen
keskukseen kohdistettuja mutaatioita selvittääkseni, miten RNA-polymeraasin
rakennemuutokset vaikuttavat peruutustilaan ja RNA:n leikkautumiseen.
Tuloksemme osoittavat, että aktiivisen keskuksen liikkuvan domeenin,
liipaisinsilmukan, laskostunut muoto stabiloi peruutustilaa ja ohjaa RNA:n
leikkautumista peruutustilassa. Lisäksi havaitsimme, että sekundäärikanavan
juuressa oleva E-kohta suojaa peruutustilassa olevaa RNA:ta leikkautumiselta.
Selvitin edelleen, miten eri transkriptiotekijät vaikuttavat peruutustilaan. Tutkin
transkription leikkaamistekijöiden GreA ja GreB indusoiman leikkautumisen
mekanismia kohdennetulla mutageneesillä. Mutaatiot Gre-tekijän kärjessä
vaikuttivat siihen, mistä kohdasta se ohjaa RNA:ta leikkautumaan. Lisäksi
havaitsin, että σ70 tehostaa RNA-polymeraasin siirtymistä peruutustilaan, millä
voi olla merkitystä transkription aloitusvaiheen säätelyssä.
syntetisoi RNA:ta DNA:n emäsjärjestyksen mukaisesti.
Transkription aikana RNA-polymeraasi satunnaisesti peruuttaa eli liikkuu
taaksepäin DNA-juostetta pitkin työntäen RNA:n 3’-pään pois aktiivisesta
keskuksesta. Peruutustilassa RNA:n pidentyminen estyy ja transkriptio
pysähtyy. Poistuakseen peruutustilasta RNA-polymeraasin on (i) liikuttava
eteenpäin tai (ii) leikattava nukleotidejä RNA:n 3’-päästä, jotta aktiivinen keskus
vapautuu. RNA-polymeraasin peruuttaminen on tärkeä osa geenien
ilmenemisen säätelyä ja RNA-polymeraasin tekemien virheiden korjaamista
kaikilla eliöillä. Peruutustilan muodostumisen ja RNA:n leikkautumisen
mekanismia ei kuitenkaan vielä täysin tunneta.
Tutkimuksessani selvitin peruutustilasta palautumisen ja RNA:n leikkautumisen
mekanismia lyhyissä peruutustiloissa. Tätä varten kehitimme koeasetelmia,
jotka mahdollistavat peruutustilan määrän ja stabiilisuuden tarkastelun.
Hyödynsin entsyymikineettisiä menetelmiä ja RNA-polymeraasin aktiiviseen
keskukseen kohdistettuja mutaatioita selvittääkseni, miten RNA-polymeraasin
rakennemuutokset vaikuttavat peruutustilaan ja RNA:n leikkautumiseen.
Tuloksemme osoittavat, että aktiivisen keskuksen liikkuvan domeenin,
liipaisinsilmukan, laskostunut muoto stabiloi peruutustilaa ja ohjaa RNA:n
leikkautumista peruutustilassa. Lisäksi havaitsimme, että sekundäärikanavan
juuressa oleva E-kohta suojaa peruutustilassa olevaa RNA:ta leikkautumiselta.
Selvitin edelleen, miten eri transkriptiotekijät vaikuttavat peruutustilaan. Tutkin
transkription leikkaamistekijöiden GreA ja GreB indusoiman leikkautumisen
mekanismia kohdennetulla mutageneesillä. Mutaatiot Gre-tekijän kärjessä
vaikuttivat siihen, mistä kohdasta se ohjaa RNA:ta leikkautumaan. Lisäksi
havaitsin, että σ70 tehostaa RNA-polymeraasin siirtymistä peruutustilaan, millä
voi olla merkitystä transkription aloitusvaiheen säätelyssä.