Investigating the role of three proteins in mitochondrial homeostasis
González de Cózar, Jose María (2021)
González de Cózar, Jose María
Tampere University
2021
Lääketieteen, biotieteiden ja biolääketieteen tekniikan tohtoriohjelma - Doctoral Programme in Medicine, Biosciences and Biomedical Engineering
Lääketieteen ja terveysteknologian tiedekunta - Faculty of Medicine and Health Technology
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Väitöspäivä
2021-05-07
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:ISBN:978-952-03-1955-7
https://urn.fi/URN:ISBN:978-952-03-1955-7
Tiivistelmä
Mitokondriot tunnetaan yleisesti eukaryoottisolujen voimalaitoksina niiden ainutlaatuisen energiatuotannon ansiosta. Tämän lisäksi mitokondriot osallistuvat solun aineenvaihdunnan, apoptoosin ja lämmöntuotannon säätelyyn. Mitokondrioilla on oma kaksijuosteiseen DNA:han koodattu genomi (mtDNA), johon sisältyvät 37 geeniä tuottavat tärkeitä osia energiantuotannosta vastaaviin entsyymikomplekseihin. MtDNA:n menetyksestä tai virheellisestä säätelystä seuraa useimmiten vakava sairaus kuten MELAS tai Alpersin syndrooma, joille ei ole parannuskeinoa. Näiden sairauksien molekylaaristen taustojen ymmärtämiseksi olisi ensimmäiseksi selvitettävä mtDNA:n ylläpitoon liittyvät mekanismit. Aiemmassa tutkimuksessa koko genomin kattava kartoitus mtDNA:n aineenvaihduntaan liittyvistä geeneistä identifioi useita uusia tai vähemmälle huomiolle jääneitä proteiineja, mukaan lukien ATP syntaasin alayksiköitä, mitokondrioiden biogeneesin säätelijöitä sekä kuljetusvesikkelien proteiineja. Hyödyntäen Drosophila melanogasteria, tunnettua malliorganismia, sekä yhdistelemällä solubiologisia, geneettisiä sekä biokemiallisia menetelmiä, esitetyt tutkimustulokset pyrkivät syventämään ymmärrystämme näiden proteiinien toiminnasta mitokondrioissa.
MtDNA:n aineenvaihduntaan liittyvien geenien kartoituksessa tunnistettiin kaksi vesikkelien kuljetukseen osallistuvaa, syntaxin 5-SNARE kompleksin alayksikköinä toimivaa proteiinia, Bet1 ja Slh. Tutkimukset osoittivat että Bet1- ja Slh- geenien ilmentymisen aleneminen ei vaikuttanut mtDNA:n määrään tai laatuun. Näiden proteiinien puutos kuitenkin johti mitokondrioiden yleiseen vajaatoimintaan heikentämällä soluhengitystä, vähentämällä mitokondrioiden määrää ja kalvopotentiaalia sekä aktivoimalla mitokondriaalista proteotoksista stressivastetta. Proteiinien solunsisäistä lokalisaatiota tutkittiin immunosytokemian avulla sekä solufraktioiden Western blot -analyysilla. Analyysit osoittivat, että sekä Bet1 että Slh lokalisoituivat Golgiin ja myöhäisiin endosomeihin. Lisäksi osa Bet1-signaalista paikantui mitokondrioihin. Bet1 paikantui immunosytokemialla samoihin rakenteisiin Mitotracker- ja Lysotracker-värjäysten kanssa. Tämä yhteislokalisaatio kuitenkin rikkoutui, kun Slh:n ilmentymistä alennettiin. Näiden sekä aiempien tulosten perusteella, esitän että endoplasmisen retikulumin (ER) ja Golgin välinen vesikkelien lajittelu toimii osana mitokondrioiden laadunvalvontajärjestelmää.
Ribonukleaasi H1 (RNase H1, jota koodaa Drosophilan rnh1 -geeni) on yksi genomin kartoituksessa identifioiduista geeneistä ja sen tehtävänä on hajottaa RNA/DNA hybridejä. Kun rnh1:n ilmentymistä tutkittiin Drosophilan S2 soluissa, geenin koodaamaa proteiinia löytyi sekä mitokondrioista että tumasta. Geenin lähetti-RNA:n kaksi vaihtoehtoista translaation aloituskohtaa tuottavat kaksi erilaista polypeptidiä, jotka näiden löydösten perusteella paikantuvat solun eri osiin. Rnh1:n puute S2 soluissa alensi mtDNA:n kopioiden määrää mutta ei vaikuttanut solujen elinkykyyn. Sen sijaan geenin matala ilmentyminen kärpäsissä aiheutti oireita, jotka vastasivat RNASEH1 mutaatiota kantavien potilaiden oireisiin. Näihin lukeutui alentunut elinikä, merkittävät motoriset häiriöt sekä puutteellinen soluhengitys, DNA replikaatio ja transkriptio. Geenin ilmentymisen modulaatioilla oli systemaattisia vaikutuksia mtDNA replikaation välimuotoihin erityisesti alueilla missä mtDNA:n transkriptio ja replikaatio etenevät vastakkaisiin suuntiin. Lisäksi pitkäaikainen rnh1:n ilmentymisen aleneminen S2 soluissa laukaisi topologisten epämuodostumien kerääntymisen. Tällaisia mtDNA:n rakenteita olivat mm. nelisuuntaiset liittymät sekä rakenteet, jotka liittyvät replikaatiohaarukan hidastumiseen replikaation aloituskohdassa. Yleisesti ottaen tulokset osoittivat, että mtDNA:n transkription ja replikaation välillä on tiukka yhteys, jossa RNaasi H1 toimii molempia prosesseja säätelevänä tekijänä.
RNaasi H1 aktiivisuuden menetyksestä johtuvien mtDNA:n rakenteellisten epämuodostumien kerääntymistä havaittiin kärpäsissä mutta ei nisäkkäissä. Tämä viittaa mitokondriaalisen genomin järjestäytymisessä ja replikaatiossa oleviin eroavaisuuksiin näiden eliöiden välillä. Drosophila RNaasi H1 entsyymi karakterisoitiin biokemiallisia analytiikkatekniikoita hyödyntäen ja sen ominaisuuksia verrattiin ihmisen vastaavaan homologiin. Eukaryoottien RNaasi H1:n tyypillinen kanoninen rakenne on myös ennustettu toteutuvan kärpäsen entsyymissä. Hybridi sitoutumisalueena (HBD, hybrid binding domain) tunnettu nukleiinihappojen sitoutumiselementti sijaitsee N-terminuksessa kun katalyyttinen alue puolestaan sijaitsee C-terminuksessa. Nämä kaksi aluetta yhdistävällä alueella ei ole tunnettua rakennetta tai toimintaa mutta karakterisointi osoitti, että Drosophilalla kyseinen alue on koolta kaksinkertainen ihmisen vastaavaan alueeseen verrattuna. In silico rakennemallinnus alueesta ennusti HBD:n kaltaista rakennetta. Erilaisten Drosophila RNaasi H1 deleetiovarianttien biokemiallinen analyysi paljasti, että toinen HBD:n kaltainen alue lisää katalyysiä mutta heikentää entsyymin sitoutumista RNA/DNA- hybridiin. Näin ollen ehdotan, että tämän toisen HDB-rakenteen tarkoitus on tehostaa entsyymin etenemistä. Proteomiikka-analyysi RNaasi H1:n kanssa vuorovaikutuksessa toimivista proteiineista identifioi osia sekä mitokondriaalisen että tuman genomin ylläpitoon osallistuvista tekijöistä. Lisäksi analyysissä löytyi useita aineenvaihdunnallisia entsyymejä, translaatiotekijöitä sekä kuljetukseen ja prosessointiin osallistuvia proteiineja. Näihin lukeutui mitokondriaalinen yksijuosteista DNA:ta sitova proteiini (mtSSB, mitochondrial single-stranded DNA binding protein). In vivo ja in vitro menetelmiä hyödyntäen, päätin analysoida mtSSB:n vuorovaikutusta RNaasi H1:n kanssa. Tutkimukset eivät kuitenkaan paljastaneet suoraa fyysistä kontaktia näiden kahden proteiinin välillä. Myöskään niiden toiminnallisesta vuorovaikutuksesta ei löytynyt todisteita.
Tutkimukseni toi uutta tietoa siitä, miten Bet1, Slh ja RNaasi H1 sekä suorasti että epäsuorasti toimivat osana mitokondrioita. Lisäksi tutkimus paljasti Drosophilan ribonukleaasin ainutlaatuisia, aiemmin tuntemattomia biokemiallisia ominaisuuksia. Huolimatta siitä, että eri tiedeyhteisöt ovat tutkineet mitokondrioita jo yli sata vuotta, nämä löydökset osoittavat, että niiden toiminnoissa ja säätelyssä on vielä paljon mitä emme ymmärrä. Lisätutkimuksia tarvitaan, jotta voisimme todella ymmärtää mekanismeja, jotka mitokondrioiden kautta säätelevät solujen aineenvaihduntaa ja energiatarpeita.
MtDNA:n aineenvaihduntaan liittyvien geenien kartoituksessa tunnistettiin kaksi vesikkelien kuljetukseen osallistuvaa, syntaxin 5-SNARE kompleksin alayksikköinä toimivaa proteiinia, Bet1 ja Slh. Tutkimukset osoittivat että Bet1- ja Slh- geenien ilmentymisen aleneminen ei vaikuttanut mtDNA:n määrään tai laatuun. Näiden proteiinien puutos kuitenkin johti mitokondrioiden yleiseen vajaatoimintaan heikentämällä soluhengitystä, vähentämällä mitokondrioiden määrää ja kalvopotentiaalia sekä aktivoimalla mitokondriaalista proteotoksista stressivastetta. Proteiinien solunsisäistä lokalisaatiota tutkittiin immunosytokemian avulla sekä solufraktioiden Western blot -analyysilla. Analyysit osoittivat, että sekä Bet1 että Slh lokalisoituivat Golgiin ja myöhäisiin endosomeihin. Lisäksi osa Bet1-signaalista paikantui mitokondrioihin. Bet1 paikantui immunosytokemialla samoihin rakenteisiin Mitotracker- ja Lysotracker-värjäysten kanssa. Tämä yhteislokalisaatio kuitenkin rikkoutui, kun Slh:n ilmentymistä alennettiin. Näiden sekä aiempien tulosten perusteella, esitän että endoplasmisen retikulumin (ER) ja Golgin välinen vesikkelien lajittelu toimii osana mitokondrioiden laadunvalvontajärjestelmää.
Ribonukleaasi H1 (RNase H1, jota koodaa Drosophilan rnh1 -geeni) on yksi genomin kartoituksessa identifioiduista geeneistä ja sen tehtävänä on hajottaa RNA/DNA hybridejä. Kun rnh1:n ilmentymistä tutkittiin Drosophilan S2 soluissa, geenin koodaamaa proteiinia löytyi sekä mitokondrioista että tumasta. Geenin lähetti-RNA:n kaksi vaihtoehtoista translaation aloituskohtaa tuottavat kaksi erilaista polypeptidiä, jotka näiden löydösten perusteella paikantuvat solun eri osiin. Rnh1:n puute S2 soluissa alensi mtDNA:n kopioiden määrää mutta ei vaikuttanut solujen elinkykyyn. Sen sijaan geenin matala ilmentyminen kärpäsissä aiheutti oireita, jotka vastasivat RNASEH1 mutaatiota kantavien potilaiden oireisiin. Näihin lukeutui alentunut elinikä, merkittävät motoriset häiriöt sekä puutteellinen soluhengitys, DNA replikaatio ja transkriptio. Geenin ilmentymisen modulaatioilla oli systemaattisia vaikutuksia mtDNA replikaation välimuotoihin erityisesti alueilla missä mtDNA:n transkriptio ja replikaatio etenevät vastakkaisiin suuntiin. Lisäksi pitkäaikainen rnh1:n ilmentymisen aleneminen S2 soluissa laukaisi topologisten epämuodostumien kerääntymisen. Tällaisia mtDNA:n rakenteita olivat mm. nelisuuntaiset liittymät sekä rakenteet, jotka liittyvät replikaatiohaarukan hidastumiseen replikaation aloituskohdassa. Yleisesti ottaen tulokset osoittivat, että mtDNA:n transkription ja replikaation välillä on tiukka yhteys, jossa RNaasi H1 toimii molempia prosesseja säätelevänä tekijänä.
RNaasi H1 aktiivisuuden menetyksestä johtuvien mtDNA:n rakenteellisten epämuodostumien kerääntymistä havaittiin kärpäsissä mutta ei nisäkkäissä. Tämä viittaa mitokondriaalisen genomin järjestäytymisessä ja replikaatiossa oleviin eroavaisuuksiin näiden eliöiden välillä. Drosophila RNaasi H1 entsyymi karakterisoitiin biokemiallisia analytiikkatekniikoita hyödyntäen ja sen ominaisuuksia verrattiin ihmisen vastaavaan homologiin. Eukaryoottien RNaasi H1:n tyypillinen kanoninen rakenne on myös ennustettu toteutuvan kärpäsen entsyymissä. Hybridi sitoutumisalueena (HBD, hybrid binding domain) tunnettu nukleiinihappojen sitoutumiselementti sijaitsee N-terminuksessa kun katalyyttinen alue puolestaan sijaitsee C-terminuksessa. Nämä kaksi aluetta yhdistävällä alueella ei ole tunnettua rakennetta tai toimintaa mutta karakterisointi osoitti, että Drosophilalla kyseinen alue on koolta kaksinkertainen ihmisen vastaavaan alueeseen verrattuna. In silico rakennemallinnus alueesta ennusti HBD:n kaltaista rakennetta. Erilaisten Drosophila RNaasi H1 deleetiovarianttien biokemiallinen analyysi paljasti, että toinen HBD:n kaltainen alue lisää katalyysiä mutta heikentää entsyymin sitoutumista RNA/DNA- hybridiin. Näin ollen ehdotan, että tämän toisen HDB-rakenteen tarkoitus on tehostaa entsyymin etenemistä. Proteomiikka-analyysi RNaasi H1:n kanssa vuorovaikutuksessa toimivista proteiineista identifioi osia sekä mitokondriaalisen että tuman genomin ylläpitoon osallistuvista tekijöistä. Lisäksi analyysissä löytyi useita aineenvaihdunnallisia entsyymejä, translaatiotekijöitä sekä kuljetukseen ja prosessointiin osallistuvia proteiineja. Näihin lukeutui mitokondriaalinen yksijuosteista DNA:ta sitova proteiini (mtSSB, mitochondrial single-stranded DNA binding protein). In vivo ja in vitro menetelmiä hyödyntäen, päätin analysoida mtSSB:n vuorovaikutusta RNaasi H1:n kanssa. Tutkimukset eivät kuitenkaan paljastaneet suoraa fyysistä kontaktia näiden kahden proteiinin välillä. Myöskään niiden toiminnallisesta vuorovaikutuksesta ei löytynyt todisteita.
Tutkimukseni toi uutta tietoa siitä, miten Bet1, Slh ja RNaasi H1 sekä suorasti että epäsuorasti toimivat osana mitokondrioita. Lisäksi tutkimus paljasti Drosophilan ribonukleaasin ainutlaatuisia, aiemmin tuntemattomia biokemiallisia ominaisuuksia. Huolimatta siitä, että eri tiedeyhteisöt ovat tutkineet mitokondrioita jo yli sata vuotta, nämä löydökset osoittavat, että niiden toiminnoissa ja säätelyssä on vielä paljon mitä emme ymmärrä. Lisätutkimuksia tarvitaan, jotta voisimme todella ymmärtää mekanismeja, jotka mitokondrioiden kautta säätelevät solujen aineenvaihduntaa ja energiatarpeita.
Kokoelmat
- Väitöskirjat [4776]